一种HER2基因扩增定量检测的引物探针组、试剂盒和系统的制作方法

本发明涉及分子生物学领域，具体涉及一种her2基因扩增定量检测的引物探针组、试剂盒和系统。

背景技术：

1、her2（human epidermal growth factor receptor 2），中文名人类表皮生长因子受体2，别称her2/neu或c-erbb-2，是一种具有酪氨酸蛋白激酶（protein tyrosinekinase，ptk）活性的跨膜蛋白。her2基因是一类原癌基因，位于人类17号染色体长臂2区1带（17q21），在正常情况下低表达或不表达，当外界环境发生某种变化时，可转变为癌基因并诱导细胞异常增殖。her2基因编码产物为分子量185kd的her2蛋白，由配体结合区、单链跨膜区和酪氨酸蛋白激酶区三部分组成，属于egfr家族四种受体之一（egfr/her1、her2、her3、her4），her2单体通常没有已知的配体相互作用，需与家族其他成员形成二聚体并产生相互关联的信号后转导激活pi3k/akt和ras/raf/mek/mapk通路，从而对细胞的增殖、分化和凋亡进行调控。

2、研究表明，her2在乳腺癌、胃癌和肺癌等多种癌细胞中均有过表达，其中乳腺癌患者的发生率为20-30%，胃癌10%~20%，肺癌1.9%~14.3%；而在结直肠癌中相对较少，占2%~5%。目前已上市的抗her2靶向药物包括曲妥珠单抗（作为1998年首个her2靶向单抗上市）、帕妥珠单抗、抗体-药物偶联物（t-dm1）、拉帕替尼、阿法替尼、吡咯替尼等。但是在针对不同的her2基因变异的情况，应当使用不同机制的药物来进行治疗。因为同样是her2基因扩增或过表达的不同癌种的患者，对抗her2药物反应并不好。

3、由于肿瘤的时空异质性广泛存在，肿瘤组织的取样可能造成组织检测结果不能反映肿瘤全貌，仅对主要病灶进行ihc检测可能影响部分患者的治疗决策。部分组织样本不可得的晚期癌症患者，由于无法进行组织活检，亦可能错过靶向治疗的机会。另外，组织样本处理欠规范、ihc和fish检测技术自身的挑战也可能导致组织检测出现假阴性结果，从而导致这部分患者无法接受靶向治疗并从中获益。

4、目前her2扩增的检测方法主要有二代测序ngs，荧光原位杂交(fish)和免疫组化（ihc），以及数字pcr的方法。二代测序方法能够同时对多个样本同时检测，但成本较高、实验周期较长，且数据分析复杂；荧光原位杂交(fish)技术检测特异性高，但是样本处理周期长，成本高(探针价格昂贵)，结果判读主观性和专业性较强；数字pcr技术可以实现绝对定量，敏感性也更高，检测的速度也很快，可以实现1-2个工作日的快速检测，但是该平台在医院或单位还很少，成本较高。

技术实现思路

1、针对上述现有技术的不足，本发明所要解决的问题是：如何提供一种her2基因扩增定量检测的引物探针组、试剂盒和系统，以解决现有检测方法存在的周期长、成本高或分析复杂的问题。

2、为了解决上述问题，本发明采用了如下的技术方案：

3、第一方面，本发明提供一种her2基因扩增定量检测的引物探针组，包括如seq idno.1-seq id no.3所示核苷酸序列的引物及探针。

4、作为一种可实施方式，还包括如seq id no.4-seq id no.6所示核苷酸序列的引物及探针。

5、第二方面，本发明提供一种her2基因扩增定量检测的试剂盒，包括所述的her2基因扩增定量检测的引物探针组。

6、作为一种可实施方式，包括1体积份的seq id no.1所示核苷酸序列的引物、1体积份的seq id no.2所示核苷酸序列的引物、0.5体积份的seq id no.3所示核苷酸序列的探针、5.5体积份的无核酸水和10体积份的pcr预混液；

7、或，还包括1体积份的seq id no.4所示核苷酸序列的引物、1体积份的seq idno.5所示核苷酸序列的引物、0.5体积份的seq id no.6所示核苷酸序列的探针、5.5体积份的无核酸水和10体积份的pcr预混液。

8、第三方面，本发明提供一种her2基因扩增定量检测的系统，包括采集模块、提取模块、扩增模块、检测模块和分析模块；

9、所述采集模块，用于采集血浆样本；

10、所述提取模块，用于从所述血浆样本中提取dna样本；

11、所述扩增模块，用于采用所述her2基因扩增定量检测的引物探针组或所述her2基因扩增定量检测的试剂盒对dna样本进行pcr扩增；

12、所述检测模块，用于对扩增后的产物进行荧光检测；

13、所述分析模块，用于对荧光检测结果进行分析，若内参基因的ct值≤35，her2基因的ct≤45且扩增曲线为“s”型，her2基因拷贝数与内参基因拷贝数均值比值≥2，则检测结果为阳性；若内参基因的ct值≤35，her2基因的ct≤45且扩增曲线为“s”型，her2基因拷贝数与内参基因拷贝数均值比值＜2，则检测结果为阴性。

14、作为一种可实施方式，所述扩增模块中pcr扩增的程序包括：95℃、活化300s；95℃、15s，56℃、35s，循环45次；25℃、保持10s。

15、作为一种可实施方式，所述分析模块中，若内参基因的ct值＞35或无扩增，则检测无效。

16、第四方面，本发明提供一种her2基因扩增定量检测的非疾病诊断目的的方法，包括：

17、采集血浆样本；

18、从所述血浆样本中提取dna样本；

19、采用所述her2基因扩增定量检测的引物探针组或所述her2基因扩增定量检测的试剂盒对dna样本进行pcr扩增；

20、对扩增后的产物进行荧光检测；

21、对荧光检测结果进行分析，若内参基因的ct值≤35，her2基因的ct≤45且扩增曲线为“s”型，her2基因拷贝数与内参基因拷贝数均值比值≥2，则检测结果为阳性；若内参基因的ct值≤35，her2基因的ct≤45且扩增曲线为“s”型，her2基因拷贝数与内参基因拷贝数均值比值＜2，则检测结果为阴性。

22、第五方面，本发明提供所述her2基因扩增定量检测的引物探针组或所述her2基因扩增定量检测的试剂盒在制备her2基因扩增定量检测试剂中的应用。

23、本发明的有益效果在于：本发明提供的一种her2基因扩增定量检测的引物探针组、试剂盒和系统，基于ctdna检测，循环肿瘤dna（ctdna）能够反映短时间内的体内肿瘤负荷，实时、动态监测药物疗效，可作为组织样本检测的有效补充，有助于避免由于肿瘤异质性带来的组织样本检测假阴性结果，并且由于液体活检样本易获取，对于不能获取组织样本的晚期癌症患者，可通过ctdna进行疗效的动态监测和管理，优化治疗方案，对缓解晚期肿瘤患者的临床症状、延长生存期及改善生活质量有重要意义。

24、荧光定量pcr也可用于her2扩增的检测，检测速度更快，2个工作日内即可得到检测结果，检测的敏感性也更好，本试剂盒采用taqman-mgb 探针设计，提高信噪比（由于在探针的3’端的淬灭基团为不发光的荧光基团），并且与报告基因在空间的位置更接近，实验通量大，一次检测多个样本、快速，价格更合适临床、检测步骤可标准化、流程化、样本可选择性：组织，血液均可进行检测。