一种人高骨转移肺腺癌细胞株及其构建方法与应用与流程

本发明涉及生物，尤其涉及一种人高骨转移肺腺癌细胞株及其构建方法与应用。

背景技术：

1、骨是肺癌患者最常见的远处转移部位，30％-40％的晚期肺癌患者会发生骨转移。肺腺癌是肺癌最重要的病理亚型，且具有明显的骨转移倾向。通常骨转移的发生意味着不良的预后，涉及多种代谢性疾病如高钙血症、病理性骨折以及脊髓压迫等，严重影响患者的生存期。但是目前对于肺腺癌骨转移的机制研究不够深入，并且缺少稳定的肺腺癌骨转移模型，这在一定程度上限制了肺腺癌骨转移的研究进展，不利于肺腺癌骨转移在临床中的诊断以及后续治疗。

2、早前国内已有学者通过体内外筛选的方式建立了肺腺癌骨转移模型，例如公开号为cn1712521a的发明公开了一种具有骨转移高潜能的肺腺癌细胞株spc-a-1bm，该细胞株通过体内外筛选及核素骨显像检测的方式建立，但是这种肺腺癌骨转移模型无法直观地观察肿瘤细胞在体内动态转移的过程；目前关于肺腺癌骨转移模型的构建，尚无绿色荧光蛋白+荧光素酶基因双标记的骨转移肺腺癌细胞株的报道。目前肺腺癌骨转移缺少稳定的动物模型，而且针对现有的高潜能骨转移的细胞株，并不是绿色荧光蛋白和荧光素酶基因双标记的细胞株，并不能快速、有效的在动物体内观察到细胞转移的动态过程。

技术实现思路

1、本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供一种人高骨转移肺腺癌细胞株及其构建方法与应用。

2、为实现上述目的，本发明采取的技术方案是：

3、本发明的第一方面是提供一种人高骨转移肺腺癌细胞株，所述人高骨转移肺腺癌细胞株为a549-gfp-luc-bm3，保藏编号为cctcc no：c2023282，保藏日期为2023年09月13日，保藏单位为中国典型培养物保藏中心，保藏单位地址为湖北省武汉市武昌区武汉大学保藏中心(武汉大学第一附属小学对面)。

4、本发明的第二方面是提供一种上述人高骨转移肺腺癌细胞株的构建方法，步骤包括：

5、s1、将经预处理的肺腺癌细胞a549-gfp-luc注射至第一实验动物左心室内进行造模处理，即得第一动物模型；

6、s2、确认所述第一动物模型发生骨转移后，进行骨组织取材，获得第一骨组织，并对所述第一骨组织进行破碎处理、消化处理、洗涤处理、重悬处理以及筛选处理后，即得初筛细胞；

7、s3、将经预处理的所述初筛细胞注射至第二实验动物左心室内进行造模处理，即得第二动物模型；

8、s4、确认所述第二动物模型发生骨转移后，进行骨组织取材，获得第二骨组织，并对所述第二骨组织进行破碎处理、消化处理、洗涤处理、重悬处理以及筛选处理后，即得复筛细胞；

9、s5、将经预处理的所述复筛细胞注射至第三实验动物左心室内进行造模处理，即得第三动物模型；

10、s6、确认所述第三动物模型发生骨转移后，进行骨组织取材，获得第三骨组织，并对所述第三骨组织进行破碎处理、消化处理、洗涤处理、重悬处理以及筛选处理后，即得所述人高骨转移肺腺癌细胞株。

11、优选地，所述第一实验动物、所述第二实验动物以及所述第三实验动物均为balb/c裸鼠。

12、优选地，所述预处理包括：对生长状态良好的能稳定表达绿色荧光蛋白和荧光素酶的细胞进行胰酶消化后，采用含10％血清的完全培养基终止消化，800rpm离心5min后用pbs进行重悬处理；

13、所述破碎处理包括：将骨组织置于2mg/ml i型胶原酶以及dmem/f12培养基的混合溶液中进行研磨处理后，再进行剪切处理，即得骨碎片；

14、所述消化处理包括：将所述骨碎片置于i型胶原酶中，37℃水浴消化25min，将未消化的骨碎片重复上述步骤2次，收集3次消化后的上清；所述洗涤处理包括：采用pbs对经所述消化处理后的骨碎片洗涤3次后，收集洗涤后的pbs；

15、所述重悬处理包括：将所述消化处理获得的上清与所述洗涤处理获得的pbs混匀后，1000rpm离心5min，采用dmem/f12培养基重悬沉淀物并进行培养，即得混合细胞；

16、所述筛选处理包括：采用含4μg/ml嘌呤霉素的完全培养基培养所述混合细胞，并对所述混合细胞进行流式荧光分选。

17、本发明的第三方面是提供一种上述人高骨转移肺腺癌细胞株构建肺腺癌骨转移动物模型的方法，步骤包括：将经预处理的所述人高骨转移肺腺癌细胞注射至实验动物左心室内进行造模处理，即得肺腺癌骨转移动物模型。

18、优选地，所述预处理包括：对所述人高骨转移肺腺癌细胞进行胰酶消化后，采用含10％血清的完全培养基终止消化，800rpm离心5min后用pbs进行重悬处理。

19、本发明的第四方面是提供一种上述人高骨转移肺腺癌细胞株或如上述构建方法构建的人高骨转移肺腺癌细胞株在筛选肺腺癌骨转移的分子标志物中的应用。

20、本发明的第五方面是提供一种上述人高骨转移肺腺癌细胞株或如上述构建方法构建的人高骨转移肺腺癌细胞株在筛选治疗骨转移性肺腺癌的药物中的应用。

21、本发明的第六方面是提供一种上述人高骨转移肺腺癌细胞株或如上述构建方法构建的人高骨转移肺腺癌细胞株在构建肿瘤免疫逃逸模型中的应用。

22、本发明的第七方面是提供一种上述人高骨转移肺腺癌细胞株或如上述构建方法构建的人高骨转移肺腺癌细胞株在构建肺腺癌耐药模型中的应用。

23、本发明采用以上技术方案，与现有技术相比，具有如下技术效果：

24、本发明的人高肺腺癌细胞株a549-gfp-luc-bm3携带的绿色荧光蛋白和荧光素酶双标记，使该细胞易于活体成像和显微示踪，适用于构建肺腺癌骨转移动物模型，筛选肺腺癌骨转移的分子标志物，鉴定肺腺癌骨转移的分子靶点，筛选或评估骨转移性肺腺癌的治疗药物等；本发明的人高骨转移肺腺癌细胞株a549-gfp-luc-bm3还可以应用于免疫健全小鼠的肺腺癌骨转移造模，开展肺腺癌细胞免疫逃逸及骨免疫微环境的相关研究，鉴定免疫治疗新靶点，评估免疫治疗效果等，极具实用价值。

技术特征：

1.一种人高骨转移肺腺癌细胞株，其特征在于，所述人高骨转移肺腺癌细胞株为a549-gfp-luc-bm3，保藏编号为cctcc no：c2023282，保藏日期为2023年09月13日，保藏单位为中国典型培养物保藏中心，保藏单位地址为湖北省武汉市武昌区武汉大学保藏中心(武汉大学第一附属小学对面)。

2.一种如权利要求1所述人高骨转移肺腺癌细胞株的构建方法，其特征在于，步骤包括：

3.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，所述预处理包括：对生长状态良好的能稳定表达绿色荧光蛋白和荧光素酶的细胞进行胰酶消化后，采用含10％血清的完全培养基终止消化，800rpm离心5min后用pbs进行重悬处理；

4.一种如权利要求1所述的人高骨转移肺腺癌细胞株构建肺腺癌骨转移动物模型的方法，其特征在于，步骤包括：将经预处理的所述人高骨转移肺腺癌细胞注射至实验动物左心室内进行造模处理，即得肺腺癌骨转移动物模型。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述预处理包括：对所述人高骨转移肺腺癌细胞进行胰酶消化后，采用含10％血清的完全培养基终止消化，800rpm离心5min后用pbs进行重悬处理。

6.一种如权利要求1所述的人高骨转移肺腺癌细胞株或如权利要求2-3任一项所述构建方法构建的人高骨转移肺腺癌细胞株在筛选肺腺癌骨转移的分子标志物中的应用。

7.一种如权利要求1所述的人高骨转移肺腺癌细胞株或如权利要求2-3任一项所述构建方法构建的人高骨转移肺腺癌细胞株在筛选治疗骨转移性肺腺癌的药物中的应用。

8.一种如权利要求1所述的人高骨转移肺腺癌细胞株或如权利要求2-3任一项所述构建方法构建的人高骨转移肺腺癌细胞株在构建肿瘤免疫逃逸模型中的应用。

9.一种如权利要求1所述的人高骨转移肺腺癌细胞株或如权利要求2-3任一项所述构建方法构建的人高骨转移肺腺癌细胞株在构建肺腺癌耐药模型中的应用。

技术总结
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种人高骨转移肺腺癌细胞株及其构建方法与应用；提供一种人高骨转移肺腺癌细胞株，人高骨转移肺腺癌细胞株为A549‑GFP‑LUC‑BM3，保藏编号为CCTCC NO：C2023282，保藏日期为2023年09月13日，保藏单位为中国典型培养物保藏中心，保藏单位地址为湖北省武汉市武昌区武汉大学保藏中心(武汉大学第一附属小学对面)；本发明的人高肺腺癌细胞株A549‑GFP‑LUC‑BM3携带的绿色荧光蛋白和荧光素酶双标记，使该细胞易于活体成像和显微示踪，适用于构建肺腺癌骨转移动物模型，筛选肺腺癌骨转移的分子标志物，鉴定肺腺癌骨转移的分子靶点，筛选或评估骨转移性肺腺癌的治疗药物等。

技术研发人员：杜玉珍,仇荣,陆悦
受保护的技术使用者：上海市第六人民医院
技术研发日：
技术公布日：2024/3/11