一种基于AIEgens荧光探针的CRISPR核酸诊断方法

本发明属于核酸检测领域领域，具体涉及一种基于aiegens荧光探针的crispr核酸诊断方法。

背景技术：

1、新型冠状病毒迅速爆发的原因是缺少有效的检测手段，同时病原微生物致病性强，传播速度快，因此开发核酸诊断技术实现病原微生物的现场检测是当下的迫切需求。

2、目前核酸诊断的标准是基于pcr（聚合酶链式反应）的诊断方法，该诊断方法具有特异性强、灵敏度高、准确性高等优点，但其扩增时间长，需要严格的温控和精密仪器，易产生气溶胶交叉污染，不适用于现场核酸诊断。除了传统标准pcr检测之外，还有rpa(重组酶聚合酶扩增)技术，lamp(环介导的等温扩增)技术，rca(滚环扩增)技术，cpa(交叉引物扩增)技术以及psr(聚合酶螺旋反应)技术等主流的核酸扩增检测技术，但是这些方法也都存在一定的优势和缺陷，比如rpa(重组酶聚合酶扩增)技术，其响应速度快，指数级放大但是rpa灵敏度较低，不能够满足临床检测要求；再比如lamp(环介导的等温扩增)技术，具有较高的灵敏度以及特异性，但是其引物设计复杂。因此，缺乏一种简单且有效的核酸检测方法，缩短检测时间，提高检测灵敏度，抑制病毒的传播速度。

3、crispr-cas系统具有高效识别核酸的能力，核酸靶标经扩增得到大量扩增子，激活cas酶的非特异性切割活性（反式切割）切割荧光探针实对目标物的检测，基于pcr-crispr的检测方法被开发并用于核酸诊断。但是现有的基于crispr的方法操作复杂，多步操作容易造成气溶胶污染；此外传统的荧光猝灭探针（bhq-dna-fam）灵敏度较低，并且有较高的信号干扰，复杂生物样本中的稳定性差。因此，开发能够有效改进crispr检测方法、提升检测灵敏度、提高检测方法的稳定性的crispr报告信号系统迫在眉睫。

技术实现思路

1、基于此，本发明的目的是提出一种基于aiegens荧光探针的crispr核酸诊断方法，以解决现有检测技术操作复杂、干扰信号强等问题。

2、为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

3、本发明的目的之一是提供一种aiegens荧光探针，该探针由修饰猝灭基团的dsdna特异性负载aiegens或者复合纳米材料修饰的dsdna特异性负载aiegens构成，其中，所述修饰猝灭基团的dsdna为以下任意一种：

4、seq id no:1所示的dna和seq id no:2所示的dna互补得到的dsdna；

5、seq id no:3所示的dna和seq id no:4所示的dna互补得到的dsdna；

6、seq id no:5所示的dna和seq id no:6所示的dna互补得到的dsdna；

7、优选地，所述seq id no:1为5’-bhq-ttattaaaaaaaaaaaaaaa-3’；

8、所述seq id no:2为5’-ttttttttttttttt-3’；

9、所述seq id no:3为5’-bhq-ttattaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa-3’；

10、所述seq id no:4为5’-bhq-ttatatttttttttttttttttttttttttttttt-3’；

11、所述seq id no:5为5’-sh-ttattttattaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa-3’；

12、所述seq id no:6为5’-tttttttttttttttttttttttttttttt-3’。

13、优选地，所述复合纳米材料为磁/金/聚多巴胺中的任意一种。

14、优选地，所述荧光探针为q-dsdna/aiegens、q-dsdna/aiegens-q、sna/aiegens，所述荧光探针中的任意一种。

15、q-dsdna/aiegens（单端猝灭型aiegens）荧光探针的工作浓度为200 nm，q-dsdna/aiegens-q（双端猝灭型aiegens）荧光探针的q-dsdna-q工作浓度为100 nm，sna/aiegens（球形核酸aiegens）荧光探针的工作浓度为7 pm。

16、优选地，所述dsdna末端延伸的ssdna用作目标核酸激活的cas12a反式切割位点；将所述dsdna末端延伸的ssdna替换为ssrna用作目标核酸激活的cas13a反式切割位点。

17、本发明的目的之二是提供一种所述aiegens荧光探针在核酸检测中的应用。

18、本发明的目的之三是提供一种用于核酸检测的crispr试剂盒，所述试剂盒包含：

19、（1）rpa、rt-rpa中的任意一种；

20、（2）crispr-aiegens信号体系，所述信号体系包括所述aiegens荧光探针。

21、优选地，rpa和/或rt-rpa和crispr-aiegens信号体系在反应前为溶液不连通的两部分。

22、优选地，所述crispr-aiegens信号体系包括所述的aiegens荧光探针、crrna、cas12a和nebufffer 2.1；所述rpa和/或rt-rpa购自乐尚生物科技有限公司。

23、优选地，所述rpa和/或rt-rpa包括rpa冻干粉，rehydration rpa buffer，rnase抑制剂，醋酸镁，引物。

24、优选地，所述rpa和/或rt-rpa位于管底部，crispr-aiegens信号体系位于管盖内；所述rpa和/或rt-rpa的体积为50 µl，crispr-aiegens信号体系的体积为10 µl。

25、优选地，cas12a的工作浓度为20 nm；crrna的工作浓度为20 nm；nebufffer 2.1工作浓度为1x（包含50 mm nacl，10 mm tris-hcl，10 mm mgcl2）。

26、本发明的目的之四是提供一种核酸体外检测方法，包括以下步骤：

27、提供crispr-aiegens信号体系、rpa和/或rt-rpa；

28、将待检测核酸样本加入到rpa、rt-rpa中的任意一种反应液内进行扩增反应，得到rpa和/或rt-rpa反应液，扩增反应结束后使crispr反应液与rpa和/或rt-rpa反应液混合均匀，得到反应混合液；

29、对所述反应混合液进行荧光信号检测。

30、本发明还提供采用本文所述的方法构建得到的基于aiegens荧光探针的crispr在检测诺如病毒、新冠病毒、埃博拉病毒、人乳头瘤病毒和猴痘病毒中的任意一种的应用。

31、本发明与现有技术相比，具有以下特点：

32、相比于传统荧光猝灭探针（bhq-ssdna-fam），本发明中的aiegens荧光探针通过dsdna结合负载多个aiegens，采用bhq或纳米材料作为高效猝灭剂，构建了一对多且无标记型aiegens荧光探针，aiegens荧光探针信噪比高，具有更高的检测灵敏度；此外球形核酸aiegens荧光探针在负载生物样本中展现出极佳的抗基质能力，此外，能够实现对目标物的恒温扩增和crispr的一体化现场诊断。

33、本发明提前将所需反应试剂和材料添加至反应单元中，只在加样时开盖一次，大大简化了操作并且避免了扩增子干扰的风险，加样后30分钟即可获得检测结果，适用于现场核酸诊断。