应用DNA链置换反应纯化微量蛋白-核酸偶联物的方法

本发明涉及蛋白纯化，具体涉及应用dna链置换反应纯化微量蛋白-核酸偶联物的方法，是一种应用dna链置换反应从微量蛋白-核酸偶联粗产物中去除过量蛋白，得到纯化的蛋白-核酸偶联物的方法。

背景技术：

1、蛋白质和dna是构成生命基础最重要的两类生物大分子，通过交联化学将两者结合形成蛋白-核酸偶联物后，可以将蛋白的分子识别、酶催化特性与dna的沃森-克里克杂交特性相结合。具有组合特性的蛋白-核酸偶联物具有广泛的应用前景，例如高选择性和灵敏度的生物标志物的检测方法、靶向性的治疗制剂以及可编程纳米组件的构建模块开发等等。其中高效稳定的蛋白和dna偶联方法至关重要。蛋白-dna的偶联方法包括非共价和共价两类，在偶联过程中，由于偶联效率无法达到100％，因此偶联粗产物中往往存在过量的未偶联上dna的蛋白。目前对于蛋白-核酸偶联物的纯化大多通过快速液相层析系统，纯化体系所需粗产物的量至少在100毫克以上。当合成体系较小，合成量不足以用液相层析系统进行纯化时，开发一种能够在小体系、微量合成粗产物中去除过量未偶联的蛋白，得到纯化的蛋白-核酸偶联物的纯化方法具有较大的应用价值。

2、dna链置换反应是一种特殊的dna反应，它涉及到dna双链中的一个单链dna段，但并不破坏双链结构，且该反应是dna的自身催化反应，不需要额外辅助物质。dna链置换反应具有反应条件温和、高选择性、高灵敏度、高效率、低成本等优点，在分子生物学、生物分析领域得到了广泛的应用。

技术实现思路

1、本发明提供一种应用dna链置换反应纯化微量蛋白-核酸偶联物的方法，是应用dna链置换反应从微量蛋白-核酸偶联粗产物中去除过量蛋白，得到纯化的蛋白-核酸偶联物的方法。

2、具体地，本发明方法通过以下步骤实现：

3、(1)将链霉亲和素磁珠与生物素修饰的纯化链(biotin-ct)混合得到链霉亲和素-生物素-纯化链复合物(sa-biotin-ct)；

4、(2)将待纯化的蛋白-核酸偶联粗产物与sa-biotin-ct孵育，得到链霉亲和素-生物素-纯化链-核酸-蛋白偶联互补复合物(sa-biotin-ct-dna-protein)产物，并用洗脱缓冲液洗涤以去除未偶联核酸的蛋白；

5、(3)将纯化置换链(help-ct)与sa-biotin-ct-dna-protein产物孵育后收集上清液，即得纯化的蛋白-核酸偶联物。

6、所述步骤(1)中，将链霉亲和素磁珠与biotin-ct以物质的量的比为1:4混合，设置反应温度为25℃，反应时间为1小时，其中biotin-ct的序列如seq id no.2所示，其5’端修饰了生物素，其长度与protien-dna中的dna序列长度一致，并设计与dna序列有1/3序列互补，所述偶联的dna序列如seq id no.1所示。反应结束后使用磁力架，待磁珠聚集稳定后弃去上清液，用洗脱缓冲液洗涤一遍，去除未结合的biotin-ct，得到sa-biotin-ct。

7、所述步骤(2)中，将步骤(1)所得sa-biotin-ct与蛋白-核酸偶联粗产物混合，设置反应温度为25℃，反应时间为1小时。其中sa-biotin-ct与蛋白-核酸偶联粗产物中核酸的物质的量的比应该大于1。此时sa-biotin-ct与蛋白-核酸偶联物中的核酸发生互补配对。由此，偶联上核酸的蛋白-核酸偶联物能与sa-biotin-ct形成sa-biotin-ct-dna-protein结合在磁珠上，而未偶联上核酸的蛋白则通过洗脱缓冲液洗涤被洗脱弃去。

8、优选地，上述步骤(2)中，应使用磁力架洗涤磁珠至少3遍以上，直至洗脱缓冲液中无法检测到蛋白为止。

9、所述步骤(3)中，将help-ct与sa-biotin-ct-dna-protein混合，设置反应温度为25℃，反应时间为1小时。其中help-ct与sa-biotin-ct-dna-protein产物的物质的量的比应为1:1。由于help-ct的序列与biotin-ct完全互补，因此链置换反应发生，蛋白-核酸偶联物被置换下来，help-ct的序列如seq id no.3所示。收集反应上清液即为去除未偶的蛋白后，纯化的蛋白-核酸偶联物。

10、优选地，上述步骤(1)、(2)、(3)中均使用恒温震荡仪将转速调至200rpm进行孵育，以确保反应能充分进行。

11、优选地，所述洗脱缓冲液用0.2m nahp2o4和0.2m na2hpo4按一定比例配置而成。

12、优选地，所述洗脱缓冲液ph值应视蛋白-核酸偶联产物中蛋白的等电点而定，ph值应远离蛋白等电点，防止在纯化过程中蛋白发成析出等情况。

13、优选的，上述步骤(2)所述洗脱缓冲液的用量为上一步反应体系的两倍，步骤(3)中的洗脱缓冲液用量则以能完全重悬起磁珠的最小体积为准。

14、经上述步骤纯化后，可应用超滤管和脱盐柱对蛋白-核酸偶联物进行浓缩和缓冲液的置换。

15、对于蛋白的具体种类、蛋白的氨基酸序列、dna的具体序列，本发明没有特殊限制。只需确保biotin-ct的序列与蛋白-核酸的dna序列设计有1/3互补，help-ct与biotin-ct完全互补即可。

16、在本发明的实施例中，所述蛋白-核酸偶联物pth-nb-trigger中的pth-nb为一甲状旁腺激素的纳米抗体，trigger为一长度24bp的核酸序列。pth-nb与trigger通过偶联剂进行偶联。其中偶联的trigger序列、纯化使用的链置换引物序列如下：

17、偶联的dna：

18、trigger

19、gatcaactgcactaggattctgtg

20、链置换反应引物：

21、biotin-ct

22、biotin cacagaatgacgacttgaccagct

23、help-ct

24、agctggtcaagtcgtcattctgtg

25、在本发明的一些实施方式中，所述从蛋白-核酸偶联粗产物去除过量蛋白得到纯化的蛋白-核酸偶联物，无需用到复杂的仪器和设备，操作简单，高效便捷。通过使用链霉亲和素磁珠和dna链置换反应，能进行微克级别的蛋白-核酸偶联粗产物的纯化，大大降低了蛋白-核酸偶联物的合成、纯化成本，且该纯化方法条件温和，由此制得的蛋白-核酸偶联产物仍然保留有良好的蛋白活性。

技术特征：

1.一种应用dna链置换反应纯化微量蛋白-核酸偶联物的方法，其特征在于，通过以下步骤实现：

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，链霉亲和素磁珠与生物素修饰的纯化链反应的物质的量比为1:4，反应温度为25℃，反应时间为1小时，生物素修饰的纯化链的序列如seq id no.2所示，其5’端修饰了生物素，其长度与蛋白-核酸偶联物中的dna序列长度一致，并设计与偶联的dna序列有1/3序列互补，所述偶联的dna序列如seq id no.1所示。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，链霉亲和素-生物素-纯化链复合物与蛋白-核酸偶联粗产物中核酸的物质的量比大于1，反应温度为25℃，反应时间为1小时，反应结束后用洗脱缓冲液洗涤磁珠3遍以上，直至洗脱缓冲液中无法检测到蛋白。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)中，将纯化置换链与链霉亲和素-生物素-纯化链-核酸-蛋白偶联互补复合物混合，纯化置换链与链霉亲和素-生物素-纯化链-核酸-蛋白偶联互补复合物的物质的量比为1:1，纯化置换链的序列与生物素修饰的纯化链序列完全互补，反应温度为25℃，反应时间为1小时，纯化置换链的序列如seq id no.3所示。

5.根据权利要求1或3所述的方法，其特征在于，所述洗脱缓冲液用0.2m nahp2o4和0.2mna2hpo4按一定比例配置而成，洗脱缓冲液的ph值不在蛋白等电点附近。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)所述洗脱缓冲液的用量为上一步反应体系的两倍，步骤(3)中的洗脱缓冲液用量则以能完全重悬起磁珠的最小体积为准。

技术总结
本发明提供应用DNA链置换反应纯化微量蛋白‑核酸偶联物的方法。通过将链霉亲和素磁珠与Biotin‑CT混合得到SA‑Biotin‑CT，将蛋白‑核酸偶联粗产物与SA‑Biotin‑CT孵育得到SA‑Biotin‑CT‑DNA‑Protein产物，并用洗脱缓冲液洗涤以去除未偶联核酸的蛋白，将Help‑CT与SA‑Biotin‑CT‑DNA‑Protein产物孵育后收集上清液获得。本发明的纯化方法可以在极小的反应体系内完成纯化，而且该纯化方法操作过程简单，条件温和，得到的蛋白‑核酸偶联物依然保留有良好的蛋白活性，极大程度的降低了蛋白‑核酸偶联物的纯化成本，提高了纯化效率。

技术研发人员：孙莲莉,宋紫晗,曾苏
受保护的技术使用者：浙江大学
技术研发日：
技术公布日：2024/1/22