一种核糖环修饰的mRNA帽类似物及其制备方法和应用与流程

本发明涉及化学及生物工程，具体涉及一种核糖环修饰的mrna帽类似物及其制备方法和应用。

背景技术：

1、真核mrna在其5'-末端带有“帽”结构，众所周知，此“帽”结构在翻译中起重要作用。天然存在的帽结构由7-甲基鸟苷组成，该鸟苷通过三磷酸桥连接到第一个转录核苷酸的5'-末端，从而导致7g(5')ppp(5')n，其中n是任何核苷酸。mrna帽在基因表达中起重要作用。帽结构可以保护mrna免受外切核酸酶的降解，使rna可以从细胞核转运到细胞质，并参与翻译起始复合物的组装。m7g(5’)ppp(5’)g(mcap)已用作体外t7或sp6 rna聚合酶转录的引物，以获得在其5'末端具有帽结构的rna。

2、通过体外转录合成mrna已经成为引入外源基因并进行表达蛋白的重要工具，并广泛应用于疾病的治疗和预防中，体外转录合成mrna使得工作人员能够制备在各种生物学应用中表现适当的rna分子。此类应用包括多肽的研究应用和商业生产，例如，在无细胞翻译体系中产生在特定位点包含“非天然”氨基酸的多肽，或在培养的细胞中产生就其活性或稳定性而言需要翻译后修饰的多肽。在后者体系中，合成进行显著更长的时间，并因此产生更多的蛋白质。

3、帽子结构与真核起始因子(elf4e)结合能力的高低决定了该mrna在细胞内的翻译表达效果。现有的帽类似物结构一般是天然的帽子结构，其mrna的翻译效果不稳定，对于不同的序列或者不同的表达宿主结果差异较大。

技术实现思路

1、本技术提供了一种核糖环修饰的mrna帽类似物及其制备方法和应用，该mrna帽类似物结构中的五元糖环上与碳原子连接的氢原子独立的被oh、烷基、o-烷基、卤素、烯基、炔基和氰基取代修饰，被修饰后的五元糖环与elf4e蛋白活性口袋结合能力更强，因此可以促进该mrna的翻译效果。同时该结构由于是非天然结构，无法被生物体内的核酶水解，也不容易被脱帽酶识别，使得帽子结构更加稳定，最终表现出更好的mrna翻译效果和更低的脱帽率。

2、一种核糖环修饰的mrna帽类似物，其包含以下结构：

3、

4、其中，x1、x2和x3分别独立的为o、ch2或nh；

5、y1、y2和y3分别独立的为o、s、se或bh3；

6、r1、r2、r3、r4、r5、r8、r9、r12、r13、r14独立的为h、oh、烷基、o-烷基、ch2-o-烷基、ch2-n-烷基、ch2-s-烷基、卤素；

7、且r2、r13不同时为oh、o-烷基，r3、r14不同时为oh、o-烷基；

8、r6、r7、r10、r11独立的为h、烷基、ch2-o-烷基、ch2-n-烷基、ch2-s-烷基、卤素；

9、b1、b2独立的为天然的、或修饰的、或非天然的核苷碱基。

10、上述x1、x2和x3分别独立的为o、ch2或nh；y1、y2和y3分别独立的为o或s。

11、上述r1、r2、r3、r4、r5、r8、r9、r12、r13、r14独立的为h、oh、甲基、乙基、丙基或丁基；r6、r7、r10、r11独立的为h、甲基、乙基、丙基或丁基。

12、上述b1、b2独立的为腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、尿嘧啶、胸腺嘧啶。

13、上述x1、x2、x3、y1、y2、y3均为o；r1、r5、r7、r9、r11均为h；r2、r13中一个为oh、一个为h或ch3；r3、r14中一个为oh、一个为h；r4、r6、r8、r10、r12为h或ch3；b1为腺嘌呤、b2为鸟嘌呤；具体结构如下所示：

14、

15、

16、上述x1、x2、x3、y1、y2、y3均为o；r1、r5、r7、r9、r10、r11、r12均为h；r2、r13中一个为oh、一个为h或ch3；r3、r14中一个为oh、一个为h；r4、r6、r8为h或ch3；b1为腺嘌呤、b2为鸟嘌呤。

17、进一步的，本发明为了改善帽类似物的加帽率和翻译效率的同时，改善脱帽率，提供一种核糖环修饰的mrna帽类似物，其为式(i)所示化合物、立体异构体、或药学上可接受的盐：

18、

19、其中，

20、x1、x2和x3分别独立地为o、ch2或nh；

21、y1、y2和y3分别独立地为o、s、se或bh3；

22、r1、r4、r5、r7、r8、分别独立地为h、oh、卤素、c1-6烷基、c1-6烷氧基、c1-6烯基、c1-6炔基、氰基；且r1、r4、r5、r7、r8中至少一个为oh、卤素、c1-6烷基、c1-6烷氧基、c1-6烯基、c1-6炔基、氰基；所述c1-6烷氧基未被取代或被r15取代，r15为c1-6烷氧基；

23、r2、r3、r13、r14分别独立地为h、oh、c1-6烷基、c1-6烷氧基、卤素；

24、r6、r9、r10、r11、r12独立地为h、c1-6烷基、c1-6烷氧基、卤素；

25、b1、b2独立地为天然的、或修饰的、或非天然的核苷碱基。

26、所述的核糖环修饰的mrna帽类似物，r2和r13中至少一个为h，r3和r14中至少一个为h。

27、所述的核糖环修饰的mrna帽类似物，r1、r4、r5、r7或r8中只有一个为oh、卤素、c1-6烷基、c1-6烷氧基、c1-6烯基、c1-6炔基、氰基；所述c1-6烷氧基未被取代或被r15取代，r15为c1-6烷氧基；r1、r4、r5、r7或r8中其余四个分别独立地为h。

28、所述的核糖环修饰的mrna帽类似物，其为式(ⅱ)所示化合物、立体异构体、或药学上可接受的盐：

29、

30、r1或r5中只有一个为oh、卤素、c1-6烷基、c1-6烷氧基、c1-6烯基、c1-6炔基、氰基；所述c1-6烷氧基未被取代或被r15取代，r15为c1-6烷氧基；r1或r5的另一个为h；

31、r13、r14分别独立地为h、oh、c1-6烷基、c1-6烷氧基、卤素；

32、b1、b2独立地为天然的、或修饰的、或非天然的核苷碱基。

33、所述的核糖环修饰的mrna帽类似物，r13、r14分别独立地为oh。

34、所述的核糖环修饰的mrna帽类似物，r1选自乙炔基、1-丙炔基、2-丙炔基、丁炔基、氰基、羟基、甲氧基、乙氧基、-o-亚甲基-o-甲基、-o-亚乙基-o-甲基、-o-亚甲基-o-乙基、-o-亚乙基-o-乙基、f或cl；r5为h。

35、或者r5选自乙炔基、1-丙炔基、2-丙炔基、丁炔基、氰基、羟基、甲氧基、乙氧基、-o-亚甲基-o-甲基、-o-亚乙基-o-甲基、-o-亚甲基-o-乙基、-o-亚乙基-o-乙基、f或cl；r1为h。

36、所述核糖环修饰的mrna帽类似物，其为式(ⅲ)所示化合物、立体异构体、或药学上可接受的盐：

37、

38、r1为oh、卤素、c1-6烷基、c1-6烷氧基、c1-6烯基、c1-6炔基、氰基；所述c1-6烷氧基未被取代或被r15取代，r15为c1-6烷氧基；

39、r13、r14分别独立地为h、oh、c1-6烷基、c1-6烷氧基、卤素；

40、b1、b2独立地为天然的、或修饰的、或非天然的核苷碱基。

41、所述的核糖环修饰的mrna帽类似物，r1为乙炔基、1-丙炔基、2-丙炔基、丁炔基、氰基、羟基、甲氧基、乙氧基、-o-亚甲基-o-甲基、-o-亚乙基-o-甲基、-o-亚甲基-o-乙基、-o-亚乙基-o-乙基、f或cl。

42、所述的核糖环修饰的mrna帽类似物，r13、r14分别独立地为h、oh、甲基、乙基、丙基、异丙基、甲氧基、乙氧基、-o-亚甲基-o-甲基、-o-亚乙基-o-甲基、-o-亚甲基-o-乙基、-o-亚乙基-o-乙基、f或cl。

43、所述的核糖环修饰的mrna帽类似物，其为以下化合物、其立体异构体、或其药学上可接受的盐：

44、

45、

46、

47、

48、

49、

50、本技术所述的核糖环修饰的mrna帽类似物，具有更高的产量、加帽率，更高的翻译效率，以及更低的脱帽率。

51、本技术还提供了一种所述的核糖环修饰的mrna帽类似物在制备体外共转录rna加帽试剂中的应用。

52、所述核糖环修饰的mrna帽类似物的应用，用于制备体外共转录rna加帽试剂。该核糖环修饰的mrna帽类似物用于t7 rna聚合酶体系或sp6 rna聚合酶体系下的mrna加帽。其中t7rna聚合酶是一种依赖dna的rna聚合酶，其对噬菌体t7启动子序列有高特异性。该酶从t7启动子插入到转录载体下游的dna上合成大量rna。t7rna聚合酶催化的ivt(体外转录)反应体系是目前最成熟的mrna制备体系。

53、通常在ivt反应体系中加入t7 rna聚合酶或sp6 rna聚合酶，同时搭配本发明所述帽类似物可以获得加帽mrna。

54、本技术还提供了一种所述核糖环修饰的mrna帽类似物的dna模板，其中所述dna模板包括含有转录起始位点的启动子区，所述转录起始位点具有在核苷酸位置+1处的第一核苷酸和在核苷酸位置+2处的第二核苷酸；以及b1与所述dna模板位置+1处的核苷碱基互补，并且b2与所述dna模板上转录模板位置+2处的核苷碱基互补。

55、本技术还提供了一种rna分子，其包含上述任一项所述的核糖环修饰的mrna帽类似物。

56、本技术还提供了一种药物组合物，其包含上述所述的rna分子，以及药学上可接受的载体。

57、本发明提供了一种核糖环修饰的mrna帽类似物及其制备方法和应用，该核糖环修饰的mrna帽类似物适用于以dna序列为模板利用体外共转录方法生产的mrna，该dna序列可以来源或改造自病毒、动物、植物等物种，同时其生产的mrna具有更低的免疫原性、更高的蛋白翻译效率、更好的稳定性。

58、本发明相比现有技术具有以下优点：

59、与现有帽结构类似物cleancap相比，本发明设计的新型帽子结构，含有五元糖环的取代基团，可以有效地固定5’末端帽子的空间结构，并且提高mrna的5’末端帽子结构与真核起始因子(elf4e)结合能力，进而可以提高mrna的翻译效果；本发明的核糖环修饰的mrna帽类似物，由于被修饰后的五元糖环分子构象优势，elf4e蛋白活性口袋结合能力更强，同时该结构不容易被脱帽酶识别，使得帽子结构更加稳定，最终表现出较好的体外转录产量以及加帽效率数据、更好的mrna翻译效果，同时具有更低的脱帽率。