金黄色葡萄球菌类肠毒素SElW的制备方法及其应用与流程

本发明涉及生物医药领域，具体地说，涉及金黄色葡萄球菌类肠毒素selw的制备方法及其应用。

背景技术：

1、葡萄球菌超抗原(staphylococcal superantigens，sags)是一类结构相关的蛋白，能激活大量t淋巴细胞，具有广泛的免疫治疗应用前景。与常规抗原相比，sags激活t细胞的过程无需抗原呈递细胞处理，可直接与主要组织相容性复合物ii类分子(majorhistocompatibility complex class ii，mhc ii)非限定性结合，从而对体内5％-20％的t淋巴细胞产生刺激激活作用，释放大量细胞因子，如il-2、ifn-γ及tfn-α等，最终促使机体产生较强的免疫应答。

2、金黄色葡萄球菌肠毒素(staphylococcal enterotoxins,ses)是一类具有较强超抗原活性的蛋白。根据肠毒素的命名原则，能使灵长类动物呕吐的称为肠毒素，不能使灵长类动物呕吐或未测定呕吐活性的称为类肠毒素(staphylococcal enterotoxin-like,sels)。肠毒素作为超抗原，在低剂量条件下可刺激细胞毒性t淋巴细胞，直接对mhc ii阳性的肿瘤细胞发挥杀伤作用，这种超抗原依赖性细胞介导的细胞毒性是肠毒素抗肿瘤的主要机制，而活化的t细胞可以分泌多种细胞因子来进一步抑制肿瘤生长。利用肠毒素具有超抗原这一特性将其开发成新型抗肿瘤药物得到了国内外的关注。研究表明，金黄色葡萄球菌肠毒素a(sea)和b(seb)刺激人外周血单核细胞(peripheral blood mononuclear cells,pbmcs)时，可分别抑制人肺癌细胞(a549)和移行细胞癌细胞生长。国内将sec2作为抗肿瘤的辅助药物已长达二十多年。但是由于ses的催吐活性，其在大剂量使用时能够诱发机体出现致呕吐、腹泻和发热等毒副作用。sels具有与ses相似的蛋白结构及超抗原活性，但无催吐活性，因此，sels的发现为肿瘤的免疫治疗提供了潜在的候选生物制剂。金黄色葡萄球菌类肠毒素selw是近年新发现的类肠毒素，在金葡菌中广泛存在，具有超抗原活性，不具有催吐活性。selw抗肿瘤应用的研究还未见文献报道，其在临床肿瘤治疗中具有良好的应用前景。

技术实现思路

1、本发明的目的是提供金黄色葡萄球菌类肠毒素selw的制备方法及其应用。

2、目前已有的金黄色葡萄球菌肠毒素(sea-sec、sek、sel和seq)肿瘤治疗，由于受到催吐活性副作用的影响，限制了其在临床上的广泛应用。而金葡菌类肠毒素selw不具有催吐活性，可用于肿瘤治疗方面。

3、为了实现本发明目的，第一方面，本发明提供金黄色葡萄球菌类肠毒素selw的制备方法，包括以下步骤：

4、(1)将含有如seq id no:1所示的核苷酸序列构建到表达载体上；

5、(2)用步骤(1)获得的表达载体转化入宿主细胞；

6、(3)诱导步骤(2)获得的宿主细胞表达金黄色葡萄球菌类肠毒素selw；

7、(4)纯化回收步骤(3)获得的表达产物。

8、进一步地，步骤(1)所述表达载体为pet28a(+)。

9、进一步地，步骤(2)所述宿主细胞为大肠杆菌。

10、进一步地，步骤(4)所述的纯化包括经镍亲和层析柱纯化的步骤。

11、大肠杆菌在诱导剂(iptg)诱导下可高效表达带有his标签的selw重组蛋白。

12、第二方面，本发明提供金黄色葡萄球菌类肠毒素selw在制备抗肿瘤活性的药物或组合物中的应用。

13、所述肿瘤包括但不限于乳腺癌、胃癌。

14、借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果：

15、(一)本发明通过去掉金黄色葡萄球菌肠毒素的信号肽序列，实现了selw蛋白的可溶性表达，提高了目的蛋白的表达量。

16、(二)本发明对重组selw蛋白进行了高表达，一次性表达量可达20ml(0.622mg/ml)，且为可溶性表达。本发明采用镍亲和层析对目的蛋白进行纯化，步骤简单，纯化效果良好。

17、(三)体外利用该蛋白刺激人外周血单个核细胞(pbmcs)，验证对乳腺癌细胞(mcf-7)、胃癌细胞(ags)及肺癌细胞(a549)的杀伤作用，结果显示selw蛋白对mcf-7和ags具有较强的抑制效果。由于该重组蛋白无催吐活性，有望开发成为一种超抗原制剂用于肿瘤患者临床治疗与康复。

技术特征：

1.金黄色葡萄球菌类肠毒素selw的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)所述表达载体为pet28a(+)。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)所述宿主细胞为大肠杆菌。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(4)所述的纯化包括经镍亲和层析柱纯化的步骤。

5.金黄色葡萄球菌类肠毒素selw在制备抗肿瘤活性的药物或组合物中的应用。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述肿瘤包括乳腺癌、胃癌。

技术总结
本发明公开了金黄色葡萄球菌类肠毒素SElW的制备方法及其应用。构建含有selw基因的重组表达质粒selw‑pET‑28a(+)，该质粒由pET‑28a(+)和SEQ ID NO:1所示的核苷酸构建而成，可转化至合适的表达宿主，在诱导剂诱导下可高效表达带有His标签的SElW重组蛋白。利用体外肿瘤细胞抑制实验证实该重组蛋白具有抗肿瘤活性。

技术研发人员：杨玉花,闫笑梅,魏销玥,孟凡亮,宫雅楠,张茂俊,张建中
受保护的技术使用者：中国疾病预防控制中心传染病预防控制所
技术研发日：
技术公布日：2024/3/12