一种绵羊MAST4基因插入/缺失多态性的检测方法及其应用

本发明属于生物技术与家畜育种领域，涉及绵羊mast4基因nc_056069.1:g.12883964-12883992位29-bp插入/缺失多态性位点的分型检测及利用相应的分子标记进行绵羊繁殖性状早期选择。

背景技术：

1、随着人们生活水平不断改善，消费者对畜禽产品的产量和品质要求也随之变化，提高畜禽生产和繁殖性能性状培育将成为动物育种的焦点。但传统育种技术耗时长、成本高，使动物育种仍面临新品种改良的挑战。随着标记辅助选择(marker-assistedselection，mas)在动物育种中的应用，可以从分子水平上快速准确地分析个体的遗传组成，从而实现对基因型的直接选择，在早期即可通过分子标记来识别具备性状优势的个体，显著提高育种效率。插入/缺失多态性(insertion/deletion,indel)是dna水平上发生频率仅次于残基替换的改变，表现为基因组中插入或缺失了不同大小的dna片段。indel均是源于单突变事件，相比snp检测简单便捷，应用价值较高。

2、绵羊(ovis aries)mast4基因位于16号染色体上，具有34个外显子，在多个组织和器官中均有表达。以往大量相关研究显示，mast4可能与哺乳动物繁殖性状有关，例如mast4通过磷酸化tctex-1促进初级纤毛重吸收(抑制mast4基因表达可阻断血清诱导的纤毛重吸收，过表达mast4基因可加速纤毛重吸收)。

3、围绕高产、优质和高效的绵羊育种目标，通过对在dna水平上筛查的与绵羊产羔数性状密切相关的分子标记进行检测，从而利用mas加快建立优良产羔数性状绵羊种群一直是关注热点。但大多数与绵羊产羔数相关的分子标记是与第一胎次(头胎)产羔数相关，而与产头胎的初产母羊相比，产第二胎次及以后胎次的经产母羊很少会出现因生产经验不足造成羔羊夭折的问题。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种绵羊mast4基因插入/缺失多态性的检测方法及其应用，可以快速建立优良性状的绵羊遗传资源群体。

2、为达到上述目的，本发明采用了以下技术方案：

3、一种绵羊mast4基因插入/缺失多态性的检测方法，包括以下步骤：

4、以待测绵羊个体全基因组dna为模板，以引物对p3为扩增引物，利用pcr扩增包含mast4基因内含子区插入/缺失多态性位点的片段，对pcr扩增产物进行电泳，根据电泳结果鉴定待测绵羊个体在所述插入/缺失多态性位点的基因型；所述插入/缺失多态性位点选自绵羊mast4基因nc_056069.1:g.12883964-12883992位29-bp插入/缺失多态性位点(缺失序列为ctaaatgcatcaatgtccaggctcttcca)。

5、优选的，所述pcr采用的扩增引物(即引物对p3)为：

6、上游引物：5'-aggacaagagtcaggggcat-3'(20nt)；

7、下游引物：5'-gggtgcagtgaataacacgg-3'(20nt)。

8、优选的，所述pcr采用的反应程序为：95℃预变性5min；94℃变性30s，68℃退火30s，72℃延伸12s，18个循环，每循环后退火温度减1℃；50℃退火30s，72℃延伸12s，32个循环；72℃延伸10min。

9、优选的，所述电泳采用质量浓度为3.5％的琼脂糖凝胶。

10、优选的，根据电泳结果，所述插入/缺失多态性位点的插入/插入基因型(ii)表现为401bp一条带纹，插入/缺失基因型(id)表现为包含401bp和372bp的带纹，缺失/缺失基因型(dd)表现为372bp一条带纹。

11、上述绵羊mast4基因插入/缺失多态性的检测方法在绵羊分子标记辅助选择育种中的应用。

12、绵羊mast4基因nc_056069.1:g.12883964-12883992位29-bp插入/缺失多态性位点(缺失序列为ctaaatgcatcaatgtccaggctcttcca)在绵羊分子标记辅助选择育种中的应用。

13、优选的，所述绵羊为澳洲白绵羊；对于该品种绵羊，所述插入/缺失多态性位点的缺失/缺失基因型(dd)可以作为提高绵羊产羔数性状的dna标记，其中产羔数具体为第二胎次产羔数。

14、优选的，所述绵羊为贵乾半细毛羊；对于该品种绵羊，所述插入/缺失多态性位点的插入/缺失基因型(id)可以作为提高绵羊产羔数性状的dna标记，其中产羔数具体为第一胎次产羔数。

15、一种绵羊mast4基因插入/缺失多态性的检测试剂盒，该试剂盒包括用于pcr扩增上述mast4基因内含子区插入/缺失多态性位点的引物对(例如，上述引物对p3)。

16、本发明的有益效果体现在：

17、本发明根据绵羊mast4基因插入/缺失多态性位点(参考序列nc_056069.1:g.12883964-12883992)设计引物，以绵羊基因组dna为模板，通过序列扩增、电泳鉴定，能够简单、快速、低成本、精确地检测所述插入/缺失多态性位点的基因型。

18、本发明对绵羊(例如，澳洲白绵羊、贵乾半细毛羊)mast4基因插入/缺失多态性位点(参考序列nc_056069.1:g.12883964-12883992)进行基因型检测分析，并对该插入/缺失多态性位点与绵羊(例如，澳洲白绵羊、贵乾半细毛羊)生产性状进行关联分析，结果表明本发明检测的插入/缺失多态性位点存在能够作为提高绵羊产羔数的分子标记，可以用于快速建立产羔数性状优良的绵羊种群，从而有利于提高良种选育速度。

技术特征：

1.一种绵羊mast4基因插入/缺失多态性的检测方法，其特征在于：包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述一种绵羊mast4基因插入/缺失多态性的检测方法，其特征在于：所述pcr的扩增引物为：

3.根据权利要求1所述一种绵羊mast4基因插入/缺失多态性的检测方法，其特征在于：所述pcr的反应程序为：95℃预变性5min；94℃变性30s，68℃退火30s，72℃延伸12s，18个循环，每循环后退火温度减1℃；50℃退火30s，72℃延伸12s，32个循环；72℃延伸10min。

4.根据权利要求1所述一种绵羊mast4基因插入/缺失多态性的检测方法，其特征在于：所述电泳采用质量浓度为3.5％的琼脂糖凝胶。

5.根据权利要求1所述一种绵羊mast4基因插入/缺失多态性的检测方法，其特征在于：根据电泳结果，所述插入/缺失多态性位点的插入/插入基因型表现为401bp一条带纹，插入/缺失基因型表现为包含401bp和372bp的带纹，缺失/缺失基因型表现为372bp一条带纹。

6.一种如权利要求1～5中任意一项所述的绵羊mast4基因插入/缺失多态性的检测方法在绵羊分子标记辅助选择育种中的应用。

7.绵羊mast4基因nc_056069.1:g.12883964-12883992位插入/缺失多态性位点在绵羊分子标记辅助选择育种中的应用。

8.根据权利要求6或7所述的应用，其特征在于：所述绵羊为澳洲白绵羊；对于澳洲白绵羊，所述插入/缺失多态性位点的缺失/缺失基因型可以作为提高绵羊产羔数性状的dna标记。

9.根据权利要求6或7所述的应用，其特征在于：所述绵羊为贵乾半细毛羊；对于贵乾半细毛羊，所述插入/缺失多态性位点的插入/缺失基因型可以作为提高绵羊产羔数性状的dna标记。

10.一种绵羊mast4基因插入/缺失多态性的检测试剂盒，其特征在于：该试剂盒包括用于pcr扩增mast4基因插入/缺失多态性位点的引物对，所述插入/缺失多态性位点选自绵羊mast4基因nc_056069.1:g.12883964-12883992位插入/缺失多态性位点。

技术总结
本发明公开了一种绵羊MAST4基因插入/缺失多态性的检测方法及其应用。以澳洲白绵羊、贵乾半细毛羊全基因组DNA为模板，通过PCR扩增MAST4基因部分片段，再进行琼脂糖凝胶电泳，根据电泳结果鉴定MAST4基因上29‑bp插入/缺失多态性位点的基因型。关联分析结果表明，MAST4基因29‑bp插入/缺失多态性位点的不同基因型与澳洲白绵羊、贵乾半细毛羊的产羔数性状差异均显著相关，并存在作为绵羊繁殖性状标记辅助选择的DNA标记，可用于快速建立优良绵羊遗传资源群体。

技术研发人员：竺蕾静,蓝贤勇,刘沛尧,宋佳君,潘传英,张清峰,郭振刚,赵海谕,曹斯琦,李杨
受保护的技术使用者：西北农林科技大学
技术研发日：
技术公布日：2024/2/19