精确快速荧光定量靶标浓度的便携式智能探测微平台及方法

本发明属于细胞生物检测，尤其涉及一种精确快速荧光定量靶标浓度的便携式智能探测微平台及方法。

背景技术：

1、细菌感染是引起人类、动物和植物多种疾病的原因，严重的致病菌感染可导致多种症状，尤其对免疫缺陷或抗生素药物的患者构成威胁。由于细菌种类众多，且不同细菌可以包含多种亚型，引起不同的症状，而每种症状都需要经过诊断识别后才能制定适当的/个性化的治疗策略，这给临床诊断和治疗带来了很多负担。快速识别细菌亚型感染并准确定量其菌体含量是及时治疗和控制感染的重要手段。传统的检测技术严重依赖昂贵的专业仪器，这大大降低了其在大规模人群筛查中的适用性。传统的细菌感染分析方法，以隐球菌为例，通常需要基于实时定量聚合酶链反应(rt-qpcr)，具有高度特异性。然而，这项技术严重依赖昂贵的qpcr仪器/程序来进行精确的温度控制和结果读出，因此在大规模临床筛查应用中受到限制。新型crispr-cas系统可以提供针对不同细菌特异性检测的核酸内切酶、探针等来检测细菌。这种基于等温扩增的探针避免了对昂贵的温度控制仪器的依赖。然而，目前的技术中，量化荧光信号仍然需要专门的仪器或程序，如荧光光谱仪，同样制约了该项技术的普及和大范围应用。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种精确快速荧光定量靶标浓度的便携式智能探测微平台及方法，能够不依赖专业仪器(例如，显微镜或电镜等高像素图像采集设备)快速、准确地定量细菌感染，并且携带方便。

2、为了解决上述所提到的技术问题，本发明具体采用以下技术方案：一种精确快速荧光定量靶标浓度的便携式智能探测微平台，包括微流道芯片、核酸荧光定量反应体系、定量检测系统；所述微流道芯片包括基底以及开设在基底上的中央进液孔；还包括围绕中央进液孔设置的阳性对照区、阴性对照区若干检测区；每个区均开设微流道与中央进液孔连通，并且每个区内均设置有若干与微流道连通的微反应室；所述微流道末端设置有出液孔；所述定量检测系统包括用于获取基于所述核酸荧光定量反应体系完成的靶标核酸荧光反应后的微反应室荧光图像的图像获取模块、用于对所述微反应室荧光图像进行优化的图像优化模块、用于识别所述微反应室荧光图像中各微反应室并获取其rgb强度的微反应室识别模块、用于根据当前检测区内所有微反应室的rgb强度计算rgb强度均值，并根据所述rgb强度均值和对应的已知靶标浓度建立两者之间的线性关系，并基于所述线性关系对目标核酸进行定量检测的定量模块；

3、所述微反应室识别模块包括：灰度阈值设置模块，用于设置阈值范围0～n以及阈值步长n，从而获得若干个灰度阈值；二值化图像获取模块，用于将像素点灰度值分别与若干灰度阈值进行比较，并将灰度值大于灰度阈值的像素点设置为白，而小于或等于灰度阈值的像素点设置为黑，从而获得若干张二值化图像；斑点组合并模块，用于将每张二值化图像中连通的白色像素分别提取为斑点，并将所有二值化图像中几何中心重叠的斑点合并为斑点组；斑点组选定模块，用于通过像素数量、凹凸性、惯性比、圆度对斑点组进行筛选从而选定代表微反应室的斑点组；(即一个斑点组对应于一个微反应室)；微反应室位置标记模块，用于记录斑点组的位置，根据斑点组的位置在经过优化处理后的所述微反应室荧光图像上标记出对应微反应室的位置；rgb强度获取模块，用于对经过优化处理后的所述微反应室荧光图像中微反应室内的像素点进行rgb值加权及平均获取每个代表微反应室的rgb强度。

4、作为一种改进，所述检测区包括亚型ⅰ检测区、亚型ⅱ检测区；所述亚型ⅰ检测区、所述亚型ⅱ检测区、所述阳性对照区、所述阴性对照区沿所述中央进液孔中心对称设置。

5、作为一种改进，所述核酸荧光定量反应体系为crispr体系，包括crispr-cas9、crispr-cas12或crispr-cas13体系中的一种。

6、作为一种改进，所述crispr体系中包含cas-12a蛋白、引物crrna、荧光报告分子和反应缓冲液；所述荧光报告分子(reporter)上连接有猝灭基团(bhq-1)和羧基荧光素(fluorescein amidite,fam)。

7、作为一种改进，所述核酸荧光定量反应体系中的各试剂以冻干形式置于与所述微流道芯片中。

8、作为一种改进，所述图像获取模块包括紫外线灯，以及集成有摄像头的智能移动终端。

9、本发明还提供一种精确快速荧光定量靶标浓度的方法，应用于上述精确快速荧光定量靶标浓度的便携式探测微平台，所述靶标为细菌靶基因，包括：

10、s01：在微流道芯片中利用预置的冻干核酸荧光定量反应体系与已知样品核酸发生反应；所述已知样品核算的靶标浓度已知；s02：利用紫外线灯对进行核酸荧光定量反应后的微流道芯片进行照射，并利用智能移动终端采集微反应室的荧光图像；s03：对采集到的微反应室荧光图像进行优化处理；s04：识别所述微反应室荧光图像中的微反应室并获取所述微反应室荧光图像中所述微反应室对应的rgb强度；s05：计算当前检测区内所有微反应室的rgb均值，并根据rgb强度均值和所述已知样品核酸的已知靶标浓度建立两者之间的线性方程；s06：在微流道芯片中加入待测样品与预置的冻干核酸荧光定量反应体系发生反应；所述待测样品的靶标浓度未知；s07：利用紫外线灯对进行核酸荧光定量反应后的微流道芯片进行照射，并利用智能移动终端采集微反应室的荧光图像；s08：对采集到的微反应室荧光图像进行优化处理；s09：识别微反应室荧光图像中的微反应室，并获取微反应室荧光图像中微反应室对应的rgb强度，并计算当前检测区内所有微反应室的rgb均值；s10：将获取到的所述待测样品的rgb强度均值带入所述线性方程计算得到所述待测样品核酸含量。

11、作为一种改进，所述对采集到的微反应室图像进行优化处理的步骤包括：采用双线性插值算法将采集到的所述微反应室荧光图像的像素扩展到预设值；利用高斯滤波减小每个像素点与周围像素点之间的亮度差异。

12、作为一种改进，所述识别所述微反应室荧光图像中的微反应室并取所述微反应室荧光图像中微反应室rgb强度的步骤包括：设置阈值范围0～n以及阈值步长n，从而获得若干个灰度阈值；将像素点灰度值分别与若干灰度阈值进行比较，并将灰度值大于阈值的像素点设置为白，而小于或等于阈值的像素点设置为黑，从而获得若干张二值化图像；将每张二值化图像中连通的白色像素分别提取为斑点，并将所有二值化图像中几何中心重叠的斑点合并为斑点组；通过像素数量、凹凸性、惯性比、圆度对斑点组进行筛选从而选定代表微反应室的斑点组；记录斑点组的位置，根据斑点组的位置在经过优化处理后的所述微反应室荧光图像上标记出微反应室的位置；对经过优化处理后的所述微反应室荧光图像中微反应室内的像素点进行rgb值加权及平均获取每个代表微反应室的rgb强度。

13、作为一种改进，利用预置的冻干核酸荧光定量反应体系与样品核酸发生反应的具体步骤如下：s01：取待测样品，裂解细胞使dna暴露，所述样品为隐球菌；s02：将含有暴露dna的样品溶液从所述芯片的中央进液孔加入，同时在所述芯片外部施加负压抽真空，使所述含有暴露dna的样品溶液充分进入芯片中并与预置的冻干核酸荧光定量反应体系发生反应；s03：所述核酸荧光定量反应体系中的、cas12a蛋白与目标样品特异性crrna结合后，释放非特异性核酸内切酶活性，将荧光报告分子上的猝灭基团和羧基荧光素切断，释放荧光；所述目标样品特异性crrna的序列如seq id no.1、seq id no.2或seq id no.3所示。

14、本发明方法所涉及到的crrna序列如下表所示。

15、表1

16、

17、本发明的有益之处在于：本发明通过微流道芯片以及预置在微流道芯片内的核酸荧光定量反应体系(例如crispr体系)对样品进行检测，再通过移动智能终端等非专业性设备来获取荧光图像，并利用定量检测系统进行图像分析处理的方式快速定量获取检测结果，并且该微平台便于携带。当样本溶液中存在目标dna时，cas12a-crrna共轭物在37℃下通过报告基因裂解激活，导致淬灭基团(bhq-1)和报告基因羧基荧光素(fluoresceinamidite,fam)之间分离，并发射放大的荧光信号荧光素。相反，在阴性区或无靶标dna的微反应室中不会产生荧光信号。隐球菌的特定亚型可通过手持式紫外线灯(480nm)识别，并由智能移动终端，例如智能手机捕捉相应荧光图像。

18、本发明整合了微流道阵列生物芯片的便携性、cripsr-cas12a技术的高特异性和智能成像程序的准确性。检测结果只需通过个人智能手机等像素并非达到专业相机或显微镜等昂贵专业设备来获取并进行图像处理得到检测，大大减轻了昂贵、不可携带仪器的负担，简化了实验要求和加速检测过程，用于临床实践中的快速筛查和准确定量。

19、本发明中，检测区域的数量可根据需求进行调整，可同时对多种细菌亚型进行检测，提高了检测效率。

20、核酸荧光定量检测体系以冻干的形式预置在微流道芯片内，提高了产品的便携性以及使用的便捷性，只需要将样品注入即可获取结果，而无需现场配置核酸荧光定量检测体系。在运输的过程中，冻干形式的核酸荧光定量检测体系因缺乏流动性会保持在预设的位置，不会四处流动导致失效。

21、检测区域以及阴、阳性对照区域沿中央进液孔中心对称设置，保证了各个区域溶液流动的一致性，提高了整个检测结果的精确程度。

22、在进行定量检测的过程中，本发明对图像进行优化处理采用双线性插值算法将采集到的图像的像素扩展到预设值例如1000像素的宽度，其目的在于排除不同图像的低像素和不一致像素的干扰。利用高斯滤波减小每个像素点与周围像素点之间的亮度差异，最小化高频噪声的影响。另外，在通过识别图像中的微反应室并获取图像中微反应室rgb强度中，本发明先进行二值化处理获取二值化图像，再从图像中识别斑点、拼合斑点从而识别出微反应室的位置所在。由于微流道芯片的尺寸较小，现有智能手机摄像头的拍摄精度也有限，采用现有的实例分割等方式很难精准的将微反应室直接从图像中分割出来。因此为了提高本发明的鲁棒性，本发明中通过上述步骤对微反应室进行了分割处理，对图像的拍摄要求大大降低。

23、最后，通过预先构建各个样品的不同靶标浓度与rgb强度之间的线性方程，即通过大量预实验来构建一个包含各种已知不同靶标浓度的样品与rgb强度之间线性关系的数据库，其中，将rgb强度作为自变量，将靶标浓度作为因变量。当获取到待检测样品对应检测区内每个微反应室的rgb强度后，计算得到该检测区的rgb均值(也即该样品对应的rgb强度)，并将其数值带入线性方程中即可求出该样品对应的靶标浓度，进一步提高了本发明使用的便捷性。