黑翅土白蚁OfDicer1的功能及其在白蚁防治中的应用

本发明涉及生物，具体涉及黑翅土白蚁ofdicer1的功能及其在白蚁防治中的应用。

背景技术：

1、白蚁是世界性害虫，危害涉及房屋建筑物、水利堤坝、管线设施以及农林植物等方面，每年造成极大的经济损失。黑翅土白蚁odontotermesformosanus(shiraki)属蜚蠊目白蚁科大白蚁亚科土白蚁属的土栖性白蚁，是为害农林植物最严重的白蚁之一，可危害多种农作物和林木。此外，黑翅土白蚁还是水利堤坝的重要害虫，为害严重时可造成崩堤垮坝。该白蚁分布范围广，主要以树根、皮层、幼苗、幼树、庄稼秸秆、甘蔗、竹根、草根、水稻等为取食对象，也能取食牛粪，食性很杂。黑翅土白蚁在同一群体内由于所处的地位不同，分工不同，有不同的品级分化，包括蚁王与蚁后、有翅成虫、兵蚁、工蚁4个品级。从外部形态和生理机能上可将白蚁个体分为生殖型和非生殖型两大类。黑翅土白蚁的防治手段主要包括物理防治、生物防治和化学防治等。物理防治主要利用物理屏障如砂砾、防水薄膜、惰性粉或塑料挡板等，保护建筑物等不受白蚁危害。化学药剂防治黑翅土白蚁是目前最主要的防治手段，但是化学药剂对环境产生较大的负面影响。生物防治具有对环境友好且不伤害非靶标生物的优点。但生物防治对白蚁的防治效果较弱，利用生物技术提高生物防治的效果，是未来的发展趋势。

2、rna干扰(rnainterference，rnai)是利用外源双链rna降解特定的mrna使目标mrna沉默的机制。rnai是一种很有价值的反向遗传学工具，可用于研究各种生物的基因功能，而且具有特异性高效性和稳定性，并且易于操作，成本较低等特点，是目前最有可能应用于害虫防治的新技术。dsrna需要在细胞内发挥rna干扰作用，在对昆虫进行相关研究时，让体外的dsrna进入细胞的方法主要包括显微注射法、喂食法和浸泡转染法，在此基础上还衍生出诸如病毒感染、共生体介导、转基因植物介导、纳米粒子包被、脂质体修饰等方法。由于dsrna高特异的靶向机制，因此，由dsrna介导的rnai在害虫防治方面有着较大的应用前景。预测今后该技术也将会得到进一步完善和发展，最终得到很好的应用。

3、dicer酶最早在秀丽隐杆线虫(caenorhabditis elegans)中被发现并被验证了功能，随后在原核、真核生物中均被报道。研究发现，大多数昆虫具有2种dicer:dicer1和dicer2，其分别在mirna和sirna两条通路中行使功能。dicer是rnai途径中的关键因子，属于rnase iii家族成员之一。所有的rnai途径都通过dicer裂解长片段的dsrna为21～25bp的小rna分子触发。最初，在果蝇dicer1和dicer2的突变体中发现，dicer1的突变可阻止mirna前体的加工。结果表明，dicer1负责前体mirna(precursor mirna，pre-mirna)的切割。dicer1切割的microrna(mirna)可以通过mirna的3'区域与目标rna保守配对调节线虫、昆虫以及植物中与mirna部分互补的mrna的稳定性或抑制其翻译，发挥着重要的基因调节作用。在果蝇中，dicer1切割带有发卡结构的60～70bp pre-mirna形成mirna，并将该成熟的mirna作为引导链，在dsrna结合蛋白loquacious(loqs)的作用下，与mirna*链结合形成复合体，这一过程则是将pre-mirna转化为双链体，从而促使mirna与rna诱导沉默复合体(rna induced silencing complex,risc)结合形成mirisc，调节内源基因的表达，最终达到沉默靶基因的目的。在果蝇中，dicer1的突变可阻止mirna前体的加工，表明dicer1与mirna的切割密切相关。

4、dicer1在基因调控、卵母细胞发育、雌性生育能力以及生物个体的正常发育起着至关重要的作用。在德国小蠊中，用dsdicer1处理其雌性成虫，发现卵子形成异常，雌性不育，究其原因是dicer1的缺失导致mirna水平缺失，说明dicer1在mirna形成过程中发挥关键作用。用dsdicer1处理的褐飞虱雌性卵母细胞较小且畸形严重，其中卵泡细胞未正常发育，细胞间边界不清晰。线虫中，dicer1发生突变可导致某些mirna的变化，调节着机体的衰老。上述研究表明，黑翅土白蚁dicer1蛋白可能在参与昆虫生长发育，抗逆等过程起着重要作用。目前，国内外关于黑翅土白蚁dicer1基因功能的研究国内外未见报道。

技术实现思路

1、本发明的目的是提供一种黑翅土白蚁基因dicer1(ofdicer1)及其dsrna，并结合粘质沙雷氏菌(serratia marcescens，sm1)来防治白蚁。

2、为实现上述目的，本发明的技术方案如下：

3、一种黑翅土白蚁ofdicer1，所述ofdicer1的核苷酸序列如seq id n0:1所示。

4、所述重组表达载体包含如seq id n0:1所示的核苷酸序列。

5、本发明提供一种转基因工程菌，所述转基因工程菌转化以上所述的重组表达载体。

6、本发明提供一种防治黑翅土白蚁的方法，所述方法包括降低黑翅土白蚁ofdicer1在黑翅土白蚁体内的表达，所述黑翅土白蚁ofdicer1的核苷酸序列如seq id n0:1所示。

7、本发明提供一种黑翅土白蚁ofdicer1在提高粘质沙雷氏菌杀虫毒力上的应用，所述ofdicer1的核苷酸序列如seq id n0:1所示。

8、本发明提供以上所述的黑翅土白蚁ofdicer1的制备方法，包括如下步骤：在黑翅土白蚁转录组数据库中，根据ncbi nucleotide-blast进行序列比对，确定获得1条黑翅土白蚁ofdicer1，使用上游引物(5’-3’)atggctgaaggagttgaatacatt和下游引物(5’-3’)ttacatcatattttttttggaaagca，进行pcr扩增获得核苷酸序列为seq id no:1。本发明提供一种黑翅土白蚁ofdicer1基因dsrna，由以上所述的黑翅土白蚁ofdicer1基因获得。

9、本发明还提供一种所述黑翅土白蚁ofdicer1基因dsrna在制备防治白蚁产品中的应用。

10、进一步的，所述dsrna在协同粘质沙雷氏菌在制备用以防治白蚁的产品中的应用。

11、本发明还提供一种防治黑翅土白蚁的方法，将以上所述dsrna处理黑翅土白蚁6-24h后，再用粘质沙雷氏菌sm1处理。

12、本发明的有益效果：

13、本发明针对获得的黑翅土白蚁ofdicer1设计dsrna(dsofdicer1)，利用rnai技术干扰抑制了黑翅土白蚁体内ofdicer1基因的表达量；通过dsofdicer1处理后的黑翅土白蚁再接触sm1生物菌，存活率显著降低，表明受菌的白蚁主动免疫被打破，并显著提高了sm1生物菌对白蚁的防治效果。本发明可应用于rnai技术结合sm1生物菌防治黑翅土白蚁。本发明防治黑翅土白蚁具有特异性强、效果优异、环境友好特点，同时还加深了黑翅土白蚁ofdicer1的生理功能及作用，还将其作为新的靶标，开发相应的免疫抑制剂，为进一步提高防治黑翅土白蚁的生物防效果提供理论依据。