一株LSDVORF123单克隆抗体的重链和轻链基因可变区序列、表达免疫球蛋白全基因序列及其应用

本发明涉及生物医学，具体为一株lsdv orf123单克隆抗体的重链和轻链可变区基因序列、表达免疫球蛋白全基因序列及其应用。

背景技术：

1、牛结节性皮肤病(lumpy skin disease,lsd)是由牛结节性皮肤病病毒(lumpyskin disease virus,lsdv)感染后引起的一种急性、亚急性接触性的传染病。lsdv主要引起牛的发热、丘疹或皮肤结节，如头、颈、肩和乳房等处，严重时呈现脓疱状损伤和组织坏死性结痂。牛结节性皮肤病(lsd)是我国近年来新发的一种重要境外输入性动物疫病，对养牛业造成了重大的经济损失，严重影响了我国养牛产业的健康发展。lsd于1929年首次被发现于赞比亚共和国，随后该病迅速向中东、东欧和中亚等地区蔓延扩散。然而，由于缺少针对该疫病有效的治疗方法和特异性疫苗，自2019年以来，lsd在全国14个省、市和自治区都有确诊发生，并呈现逐渐蔓延的趋势，防控形势日益严峻。

2、lsdv与牛痘病毒(cowpox virus，cpxv)差异很大，而与绵羊痘病毒(sheep poxvirus，sppv)和山羊痘病毒(goatpox virus，gtpv)相似，同属于羊痘病毒属(capv)。目前，我们对痘病毒基因组的理解大部分来自对痘苗病毒(vacciniavirus,vacv)的相关研究，特异性针对lsdv病毒基因组功能性的研究极其匮乏。目前，特异性针对lsdv编码蛋白生物学功能的研究极少。lsdv orf123基因长度为588bp，共编码196个氨基酸，位于eev外膜中的蛋白质。orf123蛋白是lsdv重要的结构蛋白，其具体功能尚未有明确的报道因此，深入阐述lsdv orf123蛋白的生物学功能将有助于加深对lsdv病原学及致病机制的理解。查阅文献发现lsdv orf123与痘苗病毒(vaccinavirus,vacv)编码的a34r具有同源序列，a34r基因编码c型凝集素样糖蛋白，为ii型跨膜蛋白，晚期表达，并被n-糖基化、甲基化，具有1c型lectin样结构域。vacva34r蛋白具有多种功能，参与eev的病毒粒子释放和调控病毒毒力等。目前，lsdv orf123蛋白结构和抗原特性尚不十分清楚，需要对其进行深入研究，以阐明其在lsdv感染宿主细胞过程中的作用机制。

3、前期研究中针对lsdv orf123蛋白，经过原核表达获得orf123蛋白，并将其进行纯化后免疫balb/c小鼠，检测得到相应抗体呈现阳性的小鼠后，分离脾脏细胞后与骨髓瘤细胞融合，在hat选择性培养基筛选，最终我们筛选出一株能稳定分泌lsdv orf123单克隆抗体的杂交瘤细胞株，命名为1g1-1g12。利用杂交瘤技术可以制备出高纯度的单抗，并且可以进行单克隆抗体的大量生产，然而杂交瘤过程中产生的杂交瘤细胞有可能会丢失高特异性和高活性序列风险，细胞状态好坏也有可能会影响后继的持续性研究。对此，则需要进行杂交瘤测序。经过杂交瘤测序，可以在获得相应的序列后，以重组蛋白的方式来稳定表达并获得抗体，从而使研发或生产者不必以杂交瘤细胞为载体保留该抗体，而是以碱基序列的形式进行保存，避免丢失该特异性抗体的风险。

技术实现思路

1、针对现有技术的不足，本发明提供了一株lsdv orf123单克隆抗体的重链和轻链可变区基因序列、两种表达免疫球蛋白全基因序列及其应用，解决了背景技术中提出的问题。

2、为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

3、一株lsdv orf123单克隆抗体，包括重链和轻链，其特征在于：

4、轻链可变区的3个互补决定区(cdr)序列分别为：

5、cdr1(1g1-1g12)：caaagcgttgcacataggagtggaaacagctac

6、cdr2(1g1-1g12)：aaagtttcc

7、cdr3(1g1-1g12)：tttcaaggttcacatgttccgctcacg

8、重链可变区的3个互补决定区(cdr)序列分别为：

9、cdr1(1g1-1g12)：gggtacacatttactgactatgaa

10、cdr2(1g1-1g12)：atggatcctgaaagtggtggtact

11、cdr3(1g1-1g12)：acaagatcctattactacgaaaccctctactttgactac

12、所述的轻链可变区的氨基酸序列如vl(1g1-1g12)所示；所述的重链可变区的氨基酸序列如vh(1g1-1g12)所示。

13、两种表达免疫球蛋白全基因序列如pcdna3.4-vl(1g1-1g12)、pcdna3.4-vh(1g1-1g12)所示。

14、与现有技术相比，本发明的有益效果是：

15、本专利申请中，我们利用杂交瘤测序，提取杂交瘤细胞(1g1-1g12)总rna，后以总rna中mrna为模板，进行反转录得到对应抗体基因的cdna，再用特异性pcr获得对应抗体的重链可变区(variable region ofheavy chain,vh)和轻链可变区(variable regionoflight chain,vl)，并进行克隆和测序分析。最终，我们获得靶向lsdv orf123蛋白一株单克隆抗体(1g1-1g12)重链和轻链可变区基因核苷酸序列，实现本发明。对上述单克隆细胞株抗体的重链(vh)和轻链抗体(vl)的序列分析表明：重链基因亚型为igg型，轻链为κ型。为提高抗体亲和力，进行密码子优化后，与鼠源抗体的恒定区融合，保留抗体可变区，生物工程合成并表达嵌合型抗体全基因序列。通过细胞体外培养，该嵌合型免疫球蛋白反应特性良好，外源性表达该单克隆抗体的重链和轻链(vh+vl)具有中和抗体的生物学活性。本申请公开了表达嵌合型免疫球蛋白全基因序列及其应用，旨在解决lsdv血清型的兽医检测诊断、预防和治疗或药物不完善、不全面的技术问题。

技术特征：

1.一株lsdv orf123单克隆抗体，包括重链和轻链，其特征在于：

2.根据权利要求1所述的一株lsdv orf123单克隆抗体，其特征在于，所述的轻链可变区的氨基酸序列如vl(1g1-1g12)所示；所述的重链可变区的氨基酸序列如vh(1g1-1g12)所示。

3.两种表达免疫球蛋白全基因序列如pcdna3.4-vl(1g1-1g12)、pcdna3.4-vh(1g1-1g12)所示。

技术总结
本发明涉及生物医学技术领域，具体为一株LSDV ORF123单克隆抗体的重链和轻链可变区基因序列、表达免疫球蛋白全基因序列及其应用，本发明利用杂交瘤测序，提取杂交瘤细胞(1G1‑1G12)总RNA，后以总RNA中mRNA为模板，进行反转录得到对应抗体基因的cDNA，再用特异性PCR获得对应抗体的重链可变区(Variable region ofheavy chain,V<subgt;H</subgt;)和轻链可变区(Variable region oflight chain,V<subgt;L</subgt;)，并进行克隆和测序分析。最终，获得靶向LSDV ORF123蛋白一株单克隆抗体(1G1‑1G12)重链和轻链可变区基因核苷酸序列，实现本发明。对上述一株单克隆抗体的重链(V<subgt;H</subgt;)和轻链抗体(V<subgt;L</subgt;)的序列分析表明：1G1‑1G12的V<subgt;H</subgt;和V<subgt;L</subgt;基因亚型，重链为IgG型，轻链为κ型。

技术研发人员：任善会,孙跃峰,殷相平,陈豪泰,王芳萍,王相伟,高小龙
受保护的技术使用者：中国农业科学院兰州兽医研究所
技术研发日：
技术公布日：2024/3/12