一种记忆性T细胞高效体外扩增体系的构建方法及其应用

本发明属于生物医药领域，具体涉及一种记忆性t细胞高效体外扩增体系的构建方法及其应用。

背景技术：

1、基于肿瘤浸润淋巴细胞(tumor infiltrated lymphocytes,tils)的过继性t细胞治疗(adoptive t-cell therapy,act)在宫颈癌、转移性乳腺癌、转移性结直肠癌和非小细胞肺癌(nsclc)患者中获得了良好的疗效。tils的act，首先需要将tils从切除的肿瘤组织中分离出来，随后进行体外的扩增，达到一定数量后再回输至患者体内。tils具有高度异质性，由t细胞(包括cd4+t细胞、cd8+t细胞)、b细胞、nk细胞等多种组成成分，由于cd8+t细胞高特异性的杀伤作用，是tils过继性治疗的关键成分和主要目标。因此肿瘤特异性cd8+t细胞在回输的tils中的比例极大地影响tils act的疗效。此外，效应性cd8+t细胞的杀伤反应往往只能维持较短的时间，因此，tils体外扩增过程中记忆性cd8+t细胞的诱导和维持决定了act疗效的持久性。最近越来越多的证据表明，干细胞样记忆t细胞(stem cell-likememory t cell，tscm)由于其在体内能长时间地维持和更新，与act的持久反应性密切相关。

2、目前临床常用的tils体外扩增方法主要使用细胞因子il-2作为培养基的添加物。首先加入高浓度的il-2，对tils进行预扩增；随后加入抗cd3抗体以及饲养淋巴细胞，在低浓度的il-2下进行快速扩增。在il-2培养条件下，非肿瘤特异性tils和调节性t细胞(regulatory t cells，treg)在无倾向性扩增过程中也会发生扩增和富集，限制了tils的肿瘤反应性。另一方面，tils在il-2培养条件下长期扩增过程中抗肿瘤功能的丧失和记忆表型的下降影响了act有效和持久的反应。

3、因此，需要开发创新的体外扩增策略来提升tils中肿瘤特异性cd8+t细胞的比例，同时保持记忆表型，以获得精确和持久的治疗效果。体外将tils与递呈新抗原的dc共培养是针对性促进肿瘤特异性cd8+t细胞富集的有效方式。值得注意的是，大部分肿瘤特异性cd8+t细胞包括记忆性tscm亚型呈pd-1+，与dc表面pd-l1结合形成抑制信号，影响这群细胞的增殖。因此，上调dc表面共刺激分子的表达同时抑制pd-l1的水平是促进肿瘤特异性cd8+t细胞包括记忆性tscm亚型细胞增殖的创新策略。

技术实现思路

1、本发明的目的是针对以上要解决的技术问题，提供一种能够促进t细胞体外扩增的记忆性t细胞高效体外扩增体系的构建方法。

2、为了实现以上目的，本发明提供了一种记忆性t细胞高效体外扩增体系的构建方法，其中，将t细胞与递呈特异性cd8+t细胞抗原表位的bmdc于中空纳米管阵列(hollownano-pillar array,hna)上进行共培养。

3、优选地，所述中空纳米管阵列是中空al2o3纳米管阵列。

4、优选地，所述中空纳米管阵列长度为3μm，密度为2×107/cm2。

5、优选的，所述中空纳米管阵列诱导bmdc高表达共刺激分子且低表达pd-l1。

6、优选地，所述方法还包括加入白细胞介素-2。

7、优选地，所述方法的具体步骤如下：

8、(1)分离诱导bmdc并培养；

9、(2)分离并提取t细胞：将1×106肿瘤细胞(mc38-ova)接种至小鼠皮下，11天后，取腹股沟淋巴结，于70μm细胞筛网上研磨过滤后，1600rpm离心5min，分选得到t细胞；

10、(3)体外扩增：将2×104bmdc接种于平板、hna上，12h后加入0.1μm cova250-264，12h后弃培养基，pbs润洗3遍后加入8×105个分选出的t细胞进行共培养。

11、优选地，步骤(1)如下：取c57bl/6j小鼠的胫骨和股骨骨髓，经40μm筛网过滤得到单细胞悬液后，以ack裂解液去除红细胞，随后以1×106/ml的细胞密度培养在含20ng/mlgm-csf、10ng/mg il-4的rpmi1640 10％fbs培养基中，2天后去悬浮细胞更换含10ng/mlgm-csf、5ng/ml il-4的新鲜培养基，继续培养2天后弃上清更换含10ng/ml gm-csf、5ng/mlil-4的新鲜培养基，第6天收取悬浮及贴壁松散的细胞进行后续实验。

12、优选地，在步骤(3)中加入白细胞介素-2进行共培养。

13、另一方面，本发明还提供了hna上高表达共刺激分子且低表达pd-l1的bmdc在促进记忆性t细胞体外扩增方面的应用。

14、另一方面，本发明还提供了根据所述方法获得的功能性t细胞亚群。

15、本发明目的在于构建体外抗原特异性cd8+t，包含tscm亚群细胞的快速扩增体系。本发明以临床常用方法添加细胞因子il-2作为参照，共培养体系中bmdc以未刺激/lps(脂多糖)刺激作为阴性/阳性对照。从mc38-ova荷瘤小鼠淋巴结中的分选出t细胞与递呈了ovacd8+t细胞表位多肽的bmdc共培养，而后采用ova257–264h-2kb tetramer和抗cd8的抗体识别鉴定抗原特异性cd8+t细胞。

16、本发明的方法构建了一种抗原特异性cd8+t细胞的快速扩增体系，hna上的bmdc预先经过新抗原刺激，为特异性的cd8+t细胞提供第一信号；共刺激分子高表达为cd8+t细胞的扩增提供强有力的共刺激信号，使得抗原特异性cd8+t快速激活和增殖，达到提升tils中抗原特异性cd8+t的比例的目的；同时，bmdc上pd-l1低表达有利于pd-1高表达的tscm(tcf1+pd-1+)细胞群的增殖。

17、相比仅投喂抗原未刺激的bmdc，与hna上的bmdc共培养，能显著促进抗原特异性cd8+t细胞的增殖，在仅添加细胞因子il-2的培养条件下，抗原特异性cd8+t细胞也能一定程度的扩增。联合il-2细胞，hna共培养体系能进一步促进抗原特异性cd8+t细胞的扩增。

18、此外，根据本发明构建的小鼠卵巢癌(id8)腹腔转移模型，从腹腔肿瘤微环境中分离tils进行体外扩增，以id8细胞特异性抗原多肽alvhdyfsvl(0.2μm)作为抗原，发现联合il-2、hna共培养体系也能进一步促进cd8+t的扩增。同时，相对仅添加il-2组和与lps刺激后的bmdc共培养组，hna共培养体系扩增的cd8+t细胞中记忆性tscm(tcf1+pd-1+)的比例更高，应用于id8荷瘤小鼠的过继治疗获得了更为持久的疗效。

技术特征：

1.一种记忆性t细胞高效体外扩增体系的构建方法，其特征在于，所述方法包括将t细胞与递呈特异性cd8+t细胞抗原表位的bmdc于垂直中空纳米管阵列上进行共培养。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述中空纳米管阵列是中空al2o3纳米管阵列。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述中空纳米管阵列长度为3μm，密度为2×107/cm2。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述中空纳米管阵列诱导bmdc高表达共刺激分子且低表达pd-l1。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法还包括加入白细胞介素-2。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法的具体步骤如下：

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤(1)如下：取c57bl/6j小鼠的胫骨和股骨骨髓，经40μm筛网过滤得到单细胞悬液后，以ack裂解液去除红细胞，随后以1×106/ml的细胞密度培养在含20ng/ml gm-csf、10ng/mg il-4的rpmi1640 10％fbs培养基中，2天后去悬浮细胞更换含10ng/ml gm-csf、5ng/ml il-4的新鲜培养基，继续培养2天后弃上清更换含10ng/ml gm-csf、5ng/ml il-4的新鲜培养基，第6天收取悬浮及贴壁松散的细胞进行后续实验。

8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，在步骤(3)中进一步加入白细胞介素-2进行共培养。

9.中空纳米管阵列上高表达共刺激分子且低表达pd-l1的bmdc在促进记忆性t细胞体外扩增方面的应用。

10.根据权利要求1至8中任一项所述的方法获得的功能性t细胞亚群。

技术总结
本发明公开了一种记忆性T细胞高效体外扩增体系的构建方法，其中，将T细胞与中空纳米管阵列上高表达共刺激分子低表达PD‑L1的BMDC进行共培养。本发明还提供了中空纳米管系统在促进记忆性T细胞体外扩增方面的应用。本发明目的在于构建体外抗原特异性CD8<supgt;+</supgt;T，包含记忆性Tscm亚群细胞的快速扩增体系。本发明能显著促进抗原特异性CD8<supgt;+</supgt;T细胞的增殖。

技术研发人员：王骥,蒋娟,刘昕旻,王夏峰,尚丽茹,谢曦
受保护的技术使用者：中山大学附属第一医院
技术研发日：
技术公布日：2024/3/12