基因文库的构建方法及在检测病原微生物中的应用与流程

本技术涉及基因测序领域，具体涉及一种基因文库的构建方法及在检测病原微生物中的应用。

背景技术：

1、在临床医学领域，感染性疾病一直是急危重症患者生命威胁的主要因素之一。感染病原体主要包括细菌、病毒、真菌和寄生虫等四大类。针对细菌感染，传统的诊断方法主要依赖于培养法，而对于病毒感染，则采用核酸扩增法或特异性抗原抗体检测法。然而，现有的诊断方法在敏感性、特异性、时效性以及提供信息量等方面存在一定的局限性。尤其在面对未知或罕见的病原微生物时，传统方法无法快速准确地识别，这给及时干预和治疗带来了挑战。

技术实现思路

1、本技术旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。为此，本技术的一个目的在于提出一种基因文库的构建方法及应用。

2、具体而言，本技术提供了如下技术方案：

3、在本技术的一方面，本技术提出了一种反应液。根据本技术的实施例，该所述反应液包括：40％～60％体积分数的片段化酶反应液、1-10mm datp、0.1-5mm dntp、1000-5000u/ml t4 dna聚合酶、1000-5000u/ml rtaq酶和1000-5000u/ml t4多聚核苷酸激酶。发明人通过大量实验验证发现，该反应液应用于测序文库构建过程中，实现了片段化步骤、dna末端修复和加a步骤同步进行，核酸样品的片段化以及末端修复和加a均可在该反应液中进行，极大缩减了建库时间。

4、在本技术的一些示例中，所称片段化酶反应液购自enzymatics，货号：b0330。

5、根据本技术的实施例，上述反应液还可以包括下列技术特征的至少之一：

6、根据本技术的实施例，所述datp与所述dntp的摩尔比为4:1～6:1。在本技术的一些优选示例中，datp与dntp的摩尔比为5:1。在测序文库构建应用场景中，发明人发现datp浓度过高，可能会导致a尾添加得过多，增加了文库构建后的假阳性率(特别是在pcr扩增等步骤中)。相反，如果datp浓度太低，可能无法充分完成a尾修复，导致后续连接或扩增步骤的失败。经过大量优化实验发现，datp与dntp的摩尔比为5:1时，文库构建的效果和质量更好。

7、根据本技术的实施例，该反应液包括包括50％体积分数的片段化酶反应液、2mmdatp、0.4mm dntp、1000u/ml t4 dna聚合酶、1000u/ml taq酶和1000u/ml t4多聚核苷酸激酶。经过发明人的大量实验验证，最终发现采用该配比的反应液，反应体系更加稳定，文库构建质量更好。

8、在本技术的第二方面，本技术提出了一种测序文库的构建方法。根据本技术的实施例，所述方法包括：将待测核酸样本在本技术第一方面所述的反应液中进行片段化和末端修复处理；将所述经片段化和末端修复处理的核酸样本进行接头连接处理；对接头连接处理产物进行扩增处理，以便获得所述测序文库。相比于常规构建测序文库的方法，利用本方法构建测序文库，明显缩短实验周期(建库时间缩短1小时左右)，可以大幅节省实验室人工和设备成本。

9、根据本技术的实施例，上述测序文库的构建方法还可以包括下列技术特征的至少之一：

10、根据本技术的实施例，所述片段化和末端修复处理是在如下条件下进行的：30～40℃，15～30min；60～75℃，5～20min。在本技术的一些示例中，随着反应体系的改变，发明人对相应的反应程序进行优化，最终发现在前述条件下可同步完成片段化和末端修复步骤。

11、根据本技术的实施例，所述片段化和末端修复处理是在如下条件下进行的30℃，15～30min；72℃，5～20min。发明人对片段化和末端修复的最适温度做了筛选，发现在上述温度下，酶活性更好，非特异性剪切或修复更少。

12、根据本技术的实施例，所述片段化和末端修复处理是在如下条件下进行的30℃，20min；72℃，10min。在经过大量实验筛选后，发明人确定的最优片段化和末端修复处理反应程序为30℃，20min；72℃，10min。

13、根据本技术的实施例，待测核酸样本来自实体组织样本或体液样本。

14、根据本技术的实施例，体液包括选自血液、脑脊液、痰液和肺泡灌洗液的至少之一。

15、在本技术的第三方面，本技术提出了一种测序文库。根据本技术的实施例，所述测序文库通过本技术第二方面所述的方法制备获得。通过本技术第二方面所述方法制备测序文库，可大幅缩短建库周期，且获得的测序文库质量不低于现有建库方法获得的测序文库。

16、在本技术的第四方面，本技术提出了一种测序方法。根据本技术的实施例，所述方法包括：对本技术第三方面所述的测序文库进行测序。相比以往测序过程，通过对第三方面所述的测序文库进行测序，可快速获得测序数据。

17、根据本技术的实施例，上述测序方法还可以包括下列技术特征的至少之一：

18、根据本技术的实施例，所述测序是在mgiseq-2000或bgiseq-50测序平台上进行的。在本技术的一些示例中，测序平台也可选自illumina公司的hiseq、miseq、nextseq和novaseq测序平台、thermo fisher/life technologies公司的ion torrent平台；测序方式可以选择单端测序、双末端测序或者选择所选用的自动化测序平台可支持的测序方式等。

19、在本技术的第五方面，本技术提出了一种非诊断治疗目的的微生物检测方法。根据本技术的实施例，所述方法包括：利用本技术第二方面所述的方法构建待测核酸样本的测序文库；将所述测序文库进行测序处理，以便获得测序结果；以及将所述测序结果与预定微生物参照基因序列进行比对处理，以获得所述待测核酸样本中的微生物核酸信息。

20、在本技术的一些示例中，利用高通量测序检测病原微生物能够直接对各类样本(如血液、脑脊液、痰液和肺泡灌洗液)中的微生物进行全面、无偏向性的检测，包括细菌、病毒、真菌和寄生虫等。与传统培养相比，无需分离、培养、富集纯化等传统步骤，极大地缩短了检测周期，迅速地获取病原微生物信息。

21、所称的参照基因序列(reference，ref)为已确定的序列，可以是自己预先测定组装的dna和/或rna序列，也可以是他人测定公开的dna和/或rna序列，可以是预先获得的样本来源个体/目标个体所属生物类别中的任意的参考模板，例如，同一生物类别的已公开的基因组组装序列的全部或者至少一部分。

22、在本技术的一些示例中，上述微生物检测方法可用于流行病学研究中，了解不同病原体的传播途径和变异情况，为疾病的防控和预防提供了关键性支持。

23、根据本技术的实施例，上述非诊断治疗目的的微生物检测方法还可以包括下列技术特征的至少之一：

24、根据本技术的实施例，所述待测核酸样本选自实体组织样本或体液样本。

25、根据本技术的实施例，所述体液包括选自血液、脑脊液、痰液和肺泡灌洗液的至少之一。已有的检测标本中微生物的方法对样本的要求较高，大多选择肺泡灌洗液。而利用本技术的高通量测序方法进行微生物的检测，可以突破现有检测样本的限制。

26、根据本技术的实施例，所述微生物为病原微生物。

27、在本技术的第六方面，本技术提出了一种试剂盒。根据本技术的实施例，所述试剂盒包括：本技术第一方面或任一实施例所述的反应液。在本技术的一些示例中，所述试剂盒可用于测序文库的构建。

28、根据本技术的实施例，上述试剂盒还可以包括下列技术特征的至少之一：

29、根据本技术的实施例，所述试剂盒进一步包括连接缓冲液、连接酶、标签接头、pcr反应液、pcr引物、阳性对照品、阴性对照品、内标、磁珠和溶解液中的至少之一。其中，所述内标可以为cn114107325a中所示内参序列。

30、需要说明的是，在本技术中针对第一方面所描述的特征和优点，同样适用于其他方面，在此不再赘述。

31、本技术的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本技术的实践了解到。