一种用于细胞种属鉴别和交叉污染检测的引物组合及其使用方法与流程

本技术涉及分子遗传学领域，具体涉及一种用于细胞种属鉴别和交叉污染检测的引物组合及其使用方法。

背景技术：

1、近年来，我国治疗性细胞产品在基础研究及临床应用研究中快速发展，对细胞系的种属鉴定和交叉污染检测是细胞质量控制中的关键。据《中国药典》对于细胞种属鉴定以及细胞间交叉污染的方法，主要是采用染色体分析、str图谱和同工酶图谱分析法。这些方法存在耗时长、成本高、细胞用量大和可检定的种属范围窄等问题。

2、由此，亟待提出一种有效性高、特异性好、能够迅速并且灵活应用于细胞种属鉴别和交叉污染检测的方法。

技术实现思路

1、本技术至少从以下方面解决了相关技术的问题之一。

2、为此，本技术第一方面实施例提供了一种用于细胞种属鉴别和交叉污染检测的引物组合，其中所述引物组合包含以下引物对：

3、(1)对猪cox i基因进行特异性扩增的引物对pig-cox i：

4、正向引物：5’-gtctgatcagtactaatcacagccgt-3’

5、反向引物：5’-gagctcatagtattgcgggtgatcat-3’；

6、(2)对人cox i基因进行特异性扩增的引物对human-cox i：

7、正向引物：5’-tagacatcgtactacacgacacg-3’

8、反向引物：5’-tccaggtttatggagggttc-3’；

9、(3)对猫cox i基因进行特异性扩增的引物对cat-cox i：

10、正向引物：5’-tattgccattcctaccggggtg-3’

11、反向引物：5’-acgttatattgactcctacaaacataatc-3’；

12、(4)对绵羊cox i基因进行特异性扩增的引物对sheep-cox i：

13、正向引物：5’-ctataattatcgccatcccaacaggag-3’

14、反向引物：5’-aggggaaatcaatgtacaaatcctccta-3’；

15、(5)对马cox i基因进行特异性扩增的引物对horse-cox i：

16、正向引物：5’-tgggaccctactaggagatgatcaga-3’

17、反向引物：5’-cctgttccggcacctgcttca-3’；

18、(6)对绿猴cox i基因进行特异性扩增的引物对monkey-cox i：

19、正向引物：5’-cctccttcctgctgctaatggc-3’

20、反向引物：5’-tttgatactgggatatggcg-3’；

21、(7)对大鼠cox i基因进行特异性扩增的引物对rat-cox i：

22、正向引物：5’-gtacatcttaattcttccagggtttgga-3’

23、反向引物：5’-cgggtgtctacatctaggcctactg-3’；

24、(8)对小鼠cox i基因进行特异性扩增的引物序列mouse-cox i：

25、正向引物：5’-aacagaccgcaacctaaacacaact-3’

26、反向引物：5’-atgtgaaataattccaaatcctgggagg-3’；

27、(9)对山羊cox i基因进行特异性扩增的引物对goat-cox i：

28、正向引物：5’-atatcaatcgggtttctaggatttatt-3’

29、反向引物：5’-agttgggatagcgataattatggtagc-3’；和

30、(10)对牛cox i基因进行特异性扩增的引物序列cow-cox i：

31、正向引物：5’-gctattccaaccggggtaaaagtc-3’

32、反向引物：5’-gaaaataaagcctagggctcac-3’。

33、本技术第二方面实施例提供一种包含上述第一方面实施例所述的引物组合的用于细胞种属鉴别和交叉污染检测的试剂。

34、在一些实施例中，所述试剂中各个引物对的总摩尔比值相同。

35、本技术第三方面的实施例提供一种用于细胞种属鉴别和交叉污染检测的试剂盒，其中所述试剂盒包含上述第一方面实施例所述的引物组合和上述第二方面实施例所述的试剂。

36、在一些实施例中，所述试剂盒还包含用于pcr扩增的辅助试剂。

37、在一些实施例中，所述辅助试剂包括dna聚合酶和/或阳性对照品。

38、本技术第四方面的实施例提供上述第一方面实施例所述的引物组合、上述第二方面实施例所述的试剂、上述第三方面实施例所述的试剂盒在细胞种属鉴别和交叉污染中的应用，其中所述细胞种属选自猪、人、猫、绵羊、马、绿猴、大鼠、小鼠、山羊和牛中的一种或多种。

39、在一些实施例中，所述细胞种属鉴别为鉴别待测细胞样品的种属是否为猪、人、猫、绵羊、马、绿猴、大鼠、小鼠、山羊或牛。

40、在一些实施例中，所述交叉污染检测为检测待测细胞样品是否包含一种或多种种属为猪、人、猫、绵羊、马、绿猴、大鼠、小鼠、山羊或牛的细胞。

41、本技术第五方面实施例提供一种细胞种属鉴别和交叉污染检测的方法，包括：

42、步骤s1.采用权利要求1所述的引物组合对待测细胞样本的核酸进行pcr扩增；和

43、步骤s2.表征pcr扩增的产物中的dna片段，并根据所述表征结果确定待测细胞样本是否包含一种或多种种属为猪、人、猫、绵羊、马、绿猴、大鼠、小鼠、山羊或牛的细胞。

44、在一些实施例中，所述核酸为总dna。

45、在一些实施例中，所述根据所述表征结果确定待测细胞样本是否包含一种或多种种属为猪、人、猫、绵羊、马、绿猴、大鼠、小鼠、山羊或牛的细胞包括：

46、当所述pcr扩增产物中不含有472bp的dna片段时，判定所述待测细胞样本不包含种属为猪的细胞，当所述pcr扩增产物中含有472bp的dna片段时，判定所述待测细胞样本包含种属为猪的细胞；

47、当所述pcr扩增产物中不含有425bp的dna片段时，判定所述待测细胞样本不包含种属为人的细胞，当所述pcr扩增产物中含有425bp的dna片段时，判定所述待测细胞样本包含种属为人的细胞；

48、当所述pcr扩增产物中不含有341bp的dna片段时，判定所述待测细胞样本不包含种属为猫的细胞，当所述pcr扩增产物中含有341bp的dna片段时，判定所述待测细胞样本包含种属为猫的细胞；

49、当所述pcr扩增产物中不含有271bp的dna片段时，判定所述待测细胞样本不包含种属为绵羊的细胞，当所述pcr扩增产物中含有271bp的dna片段时，判定所述待测细胞样本包含种属为绵羊的细胞；

50、当所述pcr扩增产物中不含有243bp的dna片段时，判定所述待测细胞样本不包含种属为马的细胞，当所述pcr扩增产物中含有243bp的dna片段时，判定所述待测细胞样本包含种属为马的细胞；

51、当所述pcr扩增产物中不含有222bp的dna片段时，判定所述待测细胞样本不包含种属为绿猴的细胞，当所述pcr扩增产物中含有222bp的dna片段时，判定所述待测细胞样本包含种属为绿猴的细胞；

52、当所述pcr扩增产物中不含有177bp的dna片段时，判定所述待测细胞样本不包含种属为大鼠的细胞，当所述pcr扩增产物中含有177bp的dna片段时，判定所述待测细胞样本包含种属为大鼠的细胞；

53、当所述pcr扩增产物中不含有139bp的dna片段时，判定所述待测细胞样本不包含种属为小鼠的细胞，当所述pcr扩增产物中含有139bp的dna片段时，判定所述待测细胞样本包含种属为小鼠的细胞；

54、当所述pcr扩增产物中不含有117bp的dna片段时，判定所述待测细胞样本不包含种属为山羊的细胞，当所述pcr扩增产物中含有117bp的dna片段时，判定所述待测细胞样本包含种属为山羊的细胞；和

55、当所述pcr扩增产物中不含有102bp的dna片段时，判定所述待测细胞样本不包含种属为牛的细胞，当所述pcr扩增产物中含有102bp的dna片段时，判定所述待测细胞样本包含种属为牛的细胞。

56、在一些实施例中，所述表征是通过对所述扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳实现的。

57、在一些实施例中，所述pcr扩增的体系所包含的各个引物对的总摩尔比值相同。

58、在一些实施例中，所述pcr扩增的体系包含终浓度为10-3至50ng/μl的模板。

59、在一些实施例中，所述pcr扩增的体系包含终浓度为0.1至10ng/μl的模板。

60、在一些实施例中，所述pcr扩增的体系包含终浓度为5至50μm的引物组合。

61、在一些实施例中，所述pcr扩增的体系包含终浓度为10至30μm的引物组合。

62、在一些实施例中，所述pcr扩增的程序包括：

63、(i)97至99℃反应2至4min；

64、(ii)循环反应；和

65、(iii)70至74℃完全延伸8至12min，

66、其中所述循环反应包括97至99℃反应8至12s；59至63℃反应28至32s；和68至74℃反应28至32s，其中所述循环反应的循环次数为32至38次。

67、在一些实施例中，所述pcr扩增的程序包括：

68、(i)98℃反应3min；

69、(ii)循环反应；和

70、(iii)72℃完全延伸10min，

71、其中所述循环反应包括98℃反应10s；61℃反应30s和72℃反应30s，其中所述循环反应的循环次数为35次。

72、本技术的实施例实现了如下有益效果：

73、本技术实施例提供的引物组合特异性强，能够准确鉴定不同来源的细胞种属；灵敏度高，检测限可以达到千分之一；检测范围广，涵盖了十种常见的哺乳类细胞；应用简单高效，能够同时准确确定待测样本中是否包含猪、人、猫、绵羊、马、绿猴、大鼠、小鼠、山羊和牛十种不同来源的细胞，因此具有良好的拓展性，可以作为细胞质量控制方法应用于生产细胞基质和治疗性细胞产品的质量控制。