一种抗小鼠死亡受体5胞外区的单克隆抗体

本发明属于诊断用抗体制备，包括一种抗小鼠死亡受体5胞外区的单克隆抗体，具体包括一种抗小鼠死亡受体5胞外区的单克隆抗体9d1、包含所述单克隆抗体9d1的衍生诊断产品及相关方法和应用。

背景技术：

1、肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(tnf-related apoptosis-inducing ligand，trail)是肿瘤坏死因子超家族中的一员，可通过与其受体死亡受体4(death receptor 4，dr4)/死亡受体5(death receptor 5，dr5)结合来诱导细胞凋亡，其可在对正常细胞相对安全的情况下选择性杀伤肿瘤细胞，以trail为靶点的肿瘤治疗受到了广泛关注。近年来，随着trail/trail-r的深入研究，该通路在除肿瘤之外的众多疾病的发生发展中也扮演着重要角色，例如：缺血缺氧性疾病、骨关节相关疾病、肝衰竭、炎症相关疾病等。因此，了解trail/trail-r在疾病中所发挥的作用对疾病的治疗及预后检测均具有重要的意义。

2、死亡受体5(dr5)由tnfrsf10b基因编码，在人、大鼠、小鼠中的序列非常保守。有趣的是，在小鼠中，仅存在一种携带功能性死亡结构域的trail受体，又被称为mk，mk富含半胱氨酸的胞外段、一个跨膜结构域和一个细胞质死亡结构域。mk与人dr4、dr5高度同源，并可与trail高亲和力结合。虽然dr4与dr5均可与trail结合诱导凋亡，但dr5与trail的亲和力最强，其被普遍认为是更有效的凋亡触发因子。因此，在trail相关疾病中，针对dr5的研究更加具有价值。现有的dr5单克隆抗体大多数以死亡结构域中的一段序列所制备的多肽作为免疫原，但针对小鼠dr5胞外段抗体的应用场景较为局限，这一现象导致了缺乏特异性针对小鼠dr5胞外段的抗体来应用于western blot等免疫分析实验。

3、基于trail/dr5通路与肿瘤及缺血缺氧性疾病的关系、现有dr5单克隆抗体现状、不同种属之间dr5的同源性，本发明的发明人团队通过蛋白表达与纯化获得了纯度较高的小鼠dr5胞外段蛋白，以其作为免疫原免疫大鼠制备得到了特异性抗小鼠dr5单克隆抗体，并进一步通过验证实验证明所述单克隆抗体具有优异的特异性、灵敏度和亲和力，为trail/dr5相关疾病的前期实验研究和临床治疗提供了新的策略和思路。

技术实现思路

1、针对上述现有技术中存在的问题，本发明的目的在于提供一种抗小鼠死亡受体5胞外区的单克隆抗体9d1，经实验验证发现，所述单克隆抗体9d1对dr5蛋白具有较好的特异性、灵敏度和亲和力，为本领域开发dr5蛋白相关的检测和/或辅助检测产品奠定了基础，同时，本发明有望为trail/dr5相关疾病的免疫分析及其预后监测提供更多检测工具和策略。本发明采用了如下技术方案实现上述发明目的：

2、抗死亡受体5的单克隆抗体

3、在一方面，本发明提供了一种抗死亡受体5的单克隆抗体。

4、进一步，所述单克隆抗体的重链可变区中包含三个重链互补决定区hcdr1-3，所述单克隆抗体的轻链可变区中包含三个轻链互补决定区lcdr1-3；

5、所述hcdr1、hcdr2和hcdr3的氨基酸序列分别如seq id no:1、seq id no:2和seqid no:3所示或分别如seq id no:4、seq id no:5、seq id no:6所示；

6、所述lcdr1、lcdr2和lcdr3的氨基酸序列分别如seq id no:9、seq id no:10、seqid no:11所示或分别如seq id no:12、seq id no:13、seq id no:14所示。

7、进一步，所述单克隆抗体包含：

8、(i)如seq id no:7所示的重链可变区或与seq id no:7所示的氨基酸序列具有至少80％同源性的重链可变区；

9、(ii)如seq id no:15所示的轻链可变区或与seq id no:15所示的氨基酸序列具有至少80％同源性的轻链可变区。

10、在一些实施方案中，所述重链可变区还包括如seq id no:7所示的重链可变区的功能变体，所述轻链可变区还包括如seq id no:15所示的轻链可变区的功能变体，所述功能变体通过插入、缺失和/或取代其中的一个或多个氨基酸形成，前提是功能变体保留结合死亡受体5(dr5)的能力。

11、所述功能变体包含或组成为与亲本多肽的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.1％、至少99.2％、至少99.3％、至少99.4％、至少99.5％、至少99.6％、至少99.7％、至少99.8％、或至少99.9％的序列同源性的氨基酸序列。

12、在功能变体的内容中，插入、缺失和/或取代的氨基酸的数量优选不超过亲本氨基酸序列中氨基酸总数的40％，更优选不超过35％，更优选是1％至33％，并且更优选是5％至30％，更优选是10％至25％，更优选是15％至20％。例如，插入、缺失和/或取代的氨基酸的数量可以是1至20，优选是1至10，更优选是1至7，还更优选是1至5，最优选是1至2。在优选的实施方案中，插入、缺失和/或取代的氨基酸的数量是1、2、3、4、5、6或7。在一些实施方案中，所述插入、缺失和/或取代可以在框架(fr)区，例如在fr1、fr2、fr3和/或fr4进行。

13、在一些实施方案中，一个或多个氨基酸的取代可以是一个或多个氨基酸的保守取代。此类保守取代优选地是以下组(a)至(e)中的一个氨基酸被同组中的另一个氨基酸残基取代：(a)小的脂肪族、非极性或弱极性残基：ala、ser、thr、pro和gly；(b)极性、带负电的残基及其(不带电的)酰胺：asp、asn、glu和gln；(c)极性、带正电的残基：his、arg和lys；(d)大的脂肪族、非极性残基：met、leu、he、val和cys；(e)芳香族残基：phe、tyr和trp。

14、特别优选的保守取代如下：ala到gly或到ser；arg到lys；asn到gln或到his；asp到glu；cys到ser；gln到asn；glu到asp；gly到ala或到pro；his到asn或到gln；ile到leu或到val；leu到ile或到val；lys到arg、到gln或到glu；met到leu、到tyr或到ile；phe到met、到leu或到tyr；ser到thr；thr到ser；trp到tyr；tyr到trp；和/或phe到val、到ile或到leu。

15、在一些实施方案中，本发明所述hcdr1-3、lcdr1-3对应的氨基酸序列并不局限于本发明具体列举出的序列，采用任何cdr编号方案(现有的cdr编号方案或将来产生的新的cdr编号方案)分别对如seq id no:7所示的重链可变区中的hcdr1-3进行定义、对如seq idno:15所示的轻链可变区中的lcdr1-3进行定义得到的hcdr1-3、lcdr1-3对应的抗体的氨基酸序列或核苷酸序列均在本发明的保护范围内。在具体实施方案中，所述cdr编号方案包括但不限于：imgt编号方案、kabat编号方案、chothia编号方案、martin(增强型chothia)编号方案、abm编号方案、aho编号方案、contact编号方案中的任意一种或任意多种(两种或两种以上)组合。

16、多核苷酸分子

17、在另一方面，本发明提供了一种编码本发明第一方面所述单克隆抗体的多核苷酸分子；

18、优选地，所述多核苷酸分子选自如下组：

19、(i)编码本发明第一方面所述单克隆抗体的多核苷酸分子；

20、(ii)编码本发明第一方面所述单克隆抗体的重链可变区的多核苷酸分子；

21、(iii)编码本发明第一方面所述单克隆抗体的轻链可变区的多核苷酸分子；

22、更优选地，编码本发明第一方面所述单克隆抗体的重链可变区的多核苷酸分子的序列如seq id no:8所示；

23、更优选地，编码本发明第一方面所述单克隆抗体的轻链可变区的多核苷酸分子的序列如seq id no:16所示。

24、在一些实施方案中，所述多核苷酸分子可通过重组dna技术制备得到。在本发明中，可以通过本领域技术人员已知的多种方法来制备编码本发明第一方面所述单克隆抗体的多核苷酸分子，这些方法包括但不限于：采用限制性片段操作或采用合成性寡核苷酸的重叠延伸pcr等。

25、表达载体

26、在另一方面，本发明提供了一种包含本发明第二方面所述多核苷酸分子的表达载体；

27、优选地，所述载体包括病毒来源载体、质粒载体；

28、更优选地，所述病毒来源载体包括腺病毒载体、慢病毒载体、腺相关病毒载体、疱疹病毒载体、逆转录病毒载体。

29、在一些实施方案中，包含如前所述的多核苷酸分子的载体可以是克隆载体，也可以是表达载体，在此不作限制。在一个实施方案中，载体是表达载体，例如真核表达载体，载体的实例包括但不限于：病毒、质粒、粘粒、λ噬菌体或酵母人工染色体(yac)等。在另一个实施方案中，所述载体包含任选的调控序列；在一些实施方案中，所述调控序列可以选自前导序列、多聚腺苷酸化序列、前肽序列、启动子、信号序列、转录终止子，或其任何组合，在此不作限制。

30、宿主细胞

31、在另一方面，本发明提供了一种包含本发明第三方面所述表达载体的重组宿主细胞。

32、在一些实施方案中，所述宿主细胞包括酵母细胞、哺乳动物细胞或适用于制备抗体或其抗原结合片段的其它细胞。在一些实施方案中，合适的宿主细胞包括原核微生物，如大肠杆菌。宿主细胞还可以是真核微生物如丝状真菌或酵母，或各种真核细胞，例如昆虫细胞等。也可以将脊椎动物细胞用作宿主细胞。

33、在一些实施方案中，可以使用被改造以适合于悬浮生长的哺乳动物细胞系。有用的哺乳动物宿主细胞系的例子包括sv40转化的猴肾cv1系(cos-7)；人胚肾系(hek293或293f细胞)、293细胞、幼仓鼠肾细胞(bhk)、猴肾细胞(cv1)、非洲绿猴肾细胞(vero-76)、人宫颈癌细胞(hela)、犬肾细胞(mdck)、布法罗大鼠肝脏细胞(brl 3a)、人肺细胞(w138)、人肝脏细胞(hep g2)、中国仓鼠卵巢细胞(cho细胞)、chos细胞、nso细胞、骨髓瘤细胞系如y0、ns0、p3x63和sp2/0等。适于产生蛋白质的哺乳动物宿主细胞系的综述参见例如yazaki和wu，methods in molecular biology，第248卷(b.k.c.lo编著，humana press，totowa，nj)，第255-268页(2003)。

34、生产方法

35、在另一方面，本发明提供了一种制备本发明第一方面所述单克隆抗体的方法。

36、进一步，所述方法包括：

37、(i)在适合抗体产生的条件下，培养本发明第四方面所述的重组宿主细胞，获得含有抗体的细胞培养物；

38、(ii)从步骤(i)获得的细胞培养物中分离或回收得到本发明第一方面所述的单克隆抗体。

39、检测方法

40、在另一方面，本发明提供了一种体外非诊断目的地检测死亡受体5蛋白的方法。

41、进一步，所述方法包括：

42、(i)将待测样品与本发明第一方面所述的单克隆抗体接触；

43、(ii)检测是否形成抗原-抗体复合物，其中，形成抗原-抗体复合物则表明待测样品中存在死亡受体5蛋白。

44、制备方法

45、在另一方面，本发明提供了一种制备本发明第四方面所述的重组宿主细胞的方法，所述方法包括将本发明第三方面所述的表达载体引入到宿主细胞中。

46、在一些实施方案中，可以通过本领域技术人员熟知的方法将本文描述的包含感兴趣的多核苷酸序列(例如，重链和轻链编码序列和表达控制序列)的载体转移到宿主细胞中，该方法根据细胞宿主的类型而有所不同。例如，氯化钙转染通常用于原核细胞，而磷酸钙处理、电穿孔、脂质转染、生物射弹或基于病毒的转染可用于其它细胞宿主(通常参见green和sambrook，分子克隆：实验室手册(molecular cloning:a laboratory manual)(冷泉港出版社，第4版，2012年)。用于转化哺乳动物细胞的其它方法包括使用聚凝胺、原生质体融合、脂质体、电穿孔和显微注射。

47、免疫偶联物或检测试剂盒

48、在另一方面，本发明提供了一种免疫偶联物或检测试剂盒。

49、进一步，所述免疫偶联物包含本发明第一方面所述的单克隆抗体和与所述单克隆抗体偶联的偶联物；

50、优选地，所述偶联物包括生物发光剂、放射性核素、光敏诊断剂、顺磁性离子、化学发光剂、酶；

51、更优选地，所述生物发光剂包括荧光素、水母发光蛋白；

52、更优选地，所述放射性核素包括120i、123i、124i、64cu、67cu、18f、52fe、62cu、13n、15o、86y、90y、89zr、125i、131i、186re；

53、更优选地，所述光敏诊断剂包括亚甲基蓝、二羟基硅酞菁、原卟啉、光卟啉；

54、更优选地，所述顺磁性离子包括铜(ii)、铁(iii)、铁(ii)、钴(ii)、镱(iii)、锰(ii)、镍(ii)、钆(iii)、钕(iii)、钐(iii)、钒(ii)；

55、更优选地，所述化学发光剂包括芳族吖啶酯、咪唑、异鲁米诺、鲁米诺、吖啶盐、草酸酯；

56、更优选地，所述酶包括脲酶、过氧化氢酶、辣根过氧化物酶、葡萄糖氧化酶、碱性磷酸酯酶、β-d-半乳糖苷酶、葡萄糖淀粉酶；

57、优选地，所述检测试剂盒包含本发明第一方面所述的单克隆抗体、本发明第四方面所述的重组宿主细胞或所述免疫偶联物。

58、药物组合物

59、在另一方面，本发明提供了一种药物组合物。

60、进一步，所述药物组合物包含本发明第一方面所述的单克隆抗体。

61、如下任一方面应用

62、在另一方面，本发明提供了如下任一方面应用：

63、(1)本发明第一方面所述的单克隆抗体、本发明第二方面所述的多核苷酸分子、本发明第三方面所述的表达载体、本发明第四方面所述的重组宿主细胞、本发明第七方面所述的免疫偶联物和/或检测试剂盒在非诊断目的地用于检测死亡受体5蛋白中的应用；

64、(2)本发明第一方面所述的单克隆抗体、本发明第二方面所述的多核苷酸分子、本发明第三方面所述的表达载体、本发明第四方面所述的重组宿主细胞、本发明第七方面所述的免疫偶联物和/或检测试剂盒在制备用于检测死亡受体5蛋白的产品中的应用；

65、(3)本发明第一方面所述的单克隆抗体、本发明第二方面所述的多核苷酸分子、本发明第三方面所述的表达载体、本发明第四方面所述的重组宿主细胞、本发明第七方面所述的免疫偶联物和/或检测试剂盒在制备用于诊断死亡受体5表达相关疾病的产品中的应用；

66、(4)本发明第一方面所述的单克隆抗体、本发明第二方面所述的多核苷酸分子、本发明第三方面所述的表达载体和/或本发明第四方面所述的重组宿主细胞在制备用于治疗死亡受体5表达相关疾病的药物中的应用。

67、诊断方法

68、在另一方面，本发明提供了一种诊断死亡受体5表达相关疾病的方法，所述方法包括：采用本发明第一方面所述的单克隆抗体、本发明第二方面所述的多核苷酸分子、本发明第三方面所述的表达载体、本发明第四方面所述的重组宿主细胞、本发明第七方面所述的免疫偶联物和/或检测试剂盒对受试者来源的待测样品进行检测，通过抗原抗体反应来检测待测样品中死亡受体5蛋白的水平。

69、进一步，可采用本领域技术人员已知的经典免疫组织学方法检测待测样品中死亡受体5蛋白的存在。可以体内或体外进行死亡受体5蛋白的检测。适用于检测死亡受体5蛋白存在与否的方法的实例包括但不限于：elisa、facs、ria等。

70、治疗方法

71、在另一方面，本发明提供了一种治疗死亡受体5表达相关疾病的方法，所述方法包括：给有需要的受试者施用治疗有效量的本发明第一方面所述的单克隆抗体或本发明第八方面所述的药物组合物。