结合PD-1的抗体的制作方法

本发明属于生物，涉及结合pd-1的抗体。

背景技术：

1、程序性死亡受体-1(pd-1)是在活化的t细胞、b细胞和髓样细胞上表达的免疫抑制性受体，是cd28免疫球蛋白超家族成员。pd-1为55kda的i型跨膜糖蛋白，其含有与配体结合的ig可变型结构域和负责结合信号转导分子的胞质尾区。pd-1胞质尾区含有两个基于酪氨酸的信号转导模体itim(免疫受体酪氨酸抑制基序)和itsm(免疫受体酪氨酸转换基序)。

2、现已鉴定了pd-1的两种配体，pd-l1和pd-l2，为组成型表达，或在多种细胞类型中可被诱导，这些细胞类型包括非造血组织以及各种肿瘤。pd-l1在b细胞、t细胞、髓样细胞和树突状细胞上表达，但也在外周细胞(例如微血管内皮细胞)和非淋巴器官(如心脏、肺等)中表达。与此相反，pd-l2仅在巨噬细胞和树突状细胞中存在。

3、在文献中已确定了pd-1在癌症中的作用。显示pd-1与其配体相互作用会负调节抗原受体信号转导，减弱t细胞应答。pd-1减弱调节t细胞应答的机制与ctla-4有相似也有不同之处，因为这两种分子都调控重叠的一系列信号转导蛋白。pd-l1在多种人肿瘤中都很丰富(并在大多数pd-l1阴性肿瘤细胞系中可由ifnγ诱导)。迄今有大量的研究显示pd-1和pd-l1之间的相互作用导致渗入肿瘤的淋巴细胞减少、t细胞受体介导的增殖减少和癌细胞的免疫逃避。阻断pd-1与pd-l1之间的相互作用显示可增加t细胞增殖和细胞因子产生，提高肿瘤特异性cd8+t细胞的免疫性，因此，有助于免疫系统清除肿瘤细胞。

4、通过免疫组织化学评估活组织检查业已在人的很多原发性肿瘤中发现pd-1(在肿瘤浸润淋巴细胞上)和/或pd-l1(在肿瘤细胞上)。这样的组织包括肺癌、肝癌、卵巢癌、宫颈癌、皮肤癌、结肠癌、神经胶质瘤、膀胱癌、乳腺癌、肾癌、食道癌、胃癌、口腔鳞状细胞癌、尿道上皮细胞癌和胰腺癌以及头颈肿瘤的病变组织。pd-1配体在多种肿瘤类型的肿瘤细胞上的表达与癌症患者预后不良相关联。

5、总之，pd-1/pd-l1途径是开发癌症治疗的抗体疗法的被充分证实的靶标。因此，需要识别pd-1的试剂和使用此类试剂的方法。

技术实现思路

1、本发明提供一种结合pd-1的抗体或其片段。

2、为了解决以上技术问题，在本发明的一个方面，提供一种抗体或抗体片段，其包含一个、两个、三个、四个、五个或六个选自包含具有以下所示的氨基酸序列的cdr：seq idno:13、14、15、16、17和18；或与其相比具有一个、两个或三个保守替换的氨基酸取代的氨基酸序列。

3、在一些实施方案中，所述抗体或抗体片段结合pd-1。

4、在一些实施方案中，所述抗体或抗体片段结合人pd-1(hpd-1)。

5、在一些实施方案中，所述抗体或抗体片段阻断hpd-l1(人pd-l1)与hpd-1的结合和/或破坏hpd-1/hpd-l1介导的下游信号通路。

6、在一些实施方案中，上述抗体或抗体片段中，编码seq id no:13的核苷酸序列如seq id no:2的第73-114位所示。

7、在一些实施方案中，上述任一所述的抗体或抗体片段中，编码seq id no:14的核苷酸序列如seq id no:2的第160-177位所示。

8、在一些实施方案中，上述任一所述的抗体或抗体片段中，编码seq id no:15的核苷酸序列如seq id no:2的第271-303位所示。

9、在一些实施方案中，上述任一所述的抗体或抗体片段中，编码seq id no:16的核苷酸序列如seq id no:1的第91-108位所示。

10、在一些实施方案中，上述任一所述的抗体或抗体片段中，编码seq id no:17的核苷酸序列如seq id no:1的第148-192位所示。

11、在一些实施方案中，上述任一所述的抗体或抗体片段中，编码seq id no:18的核苷酸序列如seq id no:1的第292-327位所示。

12、在一些实施方案中，上述任一所述的抗体或抗体片段中，所述抗体或抗体片段包含一个、两个或三个选自具有以下所示的氨基酸序列的重链cdr：seq id no:16、17和18；和/或，

13、所述抗体或抗体片段包含一个、两个或三个选自具有以下所示的氨基酸序列的轻链cdr：seq id no:13、14和15。

14、在一些实施方案中，上述任一所述的抗体或抗体片段中，所述抗体或抗体片段包含具有以下所示的氨基酸序列的轻链cdr：seq id no:13、14和15以及具有以下所示的氨基酸序列的重链cdr：seq id no:16、17和18。

15、在一些实施方案中，所述抗体或抗体片段为分离的抗体或抗体片段。

16、在一些实施方案中，上述任一所述的抗体或抗体片段中，所述抗体或抗体片段包含重链可变区和轻链可变区；所述重链可变区包含具有seq id no:7所示的氨基酸序列，或与seq id no:7所示的氨基酸序列具有至少90％，或至少95％，至少98％或者至少99％同一性的氨基酸序列，或与seq id no:7所示的氨基酸序列相比具有一个或多个保守氨基酸取代的氨基酸序列；和/或，所述轻链可变区包含具有seq id no:8所示的氨基酸序列，与seqid no:8所示的氨基酸序列具有至少90％，或至少95％，至少98％或者至少99％同一性的氨基酸序列，或与seq id no:8所示的氨基酸序列相比具有一个或多个保守氨基酸取代的氨基酸序列。

17、在一些实施方案中，上述任一所述的抗体或抗体片段中，所述抗体或抗体片段包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含具有seq id no:7所示的氨基酸序列，轻链可变区包含具有seq id no:8所示的氨基酸序列。

18、在一些实施方案中，上述任一所述的抗体或抗体片段中，编码seq id no:7的核苷酸序列如seq id no:1所示，编码seq id no:8的核苷酸序列如seq id no:2所示。

19、在一些实施方案中，上述任一所述的抗体或抗体片段中，所述抗体或抗体片段进一步包含人γ4重链恒定区或其变体和/或人κ轻链恒定区或其变体。

20、为了解决以上技术问题，本发明还提供一种抗体或抗体片段，所述抗体或抗体片段包含重链和轻链，所述重链包含如seq id no:71所示的氨基酸序列，与seq id no:71所示的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列，或与seq id no:71所示的氨基酸序列相比具有一个或多个保守氨基酸取代的氨基酸序列；所述轻链包含如seq id no:72所示的氨基酸序列，与seq id no:72所示的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列，或与seq id no:72所示的氨基酸序列相比具有一个或多个保守氨基酸取代的氨基酸序列。

21、在一些实施方案中，上述任一所述的抗体或抗体片段中，所述抗体或抗体片段包含seq id no:71所示的重链和/或seq id no:72所示的轻链。

22、在一些实施方案中，上述任一所述的抗体或抗体片段中，所述抗体或抗体片段包含seq id no:71所示的重链和seq id no:72所示的轻链。

23、在一些实施方案中，上述任一所述的抗体或抗体片段中，编码seq id no:71的核苷酸序列如seq id no:73所示，编码seq id no:72的核酸序列如seq id no:74所示。

24、在一些实施方案中，上述任一所述的抗体或抗体片段中，所述抗体或抗体片段为人抗体或人抗体片段。

25、在一些实施方案中，上述任一所述的抗体或抗体片段中，所述抗体片段为fab、fv或scfv抗体。

26、在一些实施方案中，上述任一所述的抗体或抗体片段中，所述抗体或抗体片段为单克隆抗体(包括全长单克隆抗体)、多克隆抗体或多特异性抗体(例如双特异性抗体)。

27、在一些实施方案中，上述任一所述的抗体或抗体片段中，所述变体包含至多20个、至多10个、至多5个或至多3个保守替换的氨基酸取代。

28、为了解决以上技术问题，在本发明的另一个方面，还提供上述任一项所述的抗体或抗体片段的变体，其包含一个、两个或三个保守替换的氨基酸取代，同时保持与所述抗体或抗体片段相同的功能。

29、为了解决以上技术问题，在本发明的另一个方面，还提供如下b1)或b2)的生物材料：

30、b1)编码上述任一项所述的抗体或抗体片段或变体的核酸分子；

31、所述核酸分子可以是dna，如cdna、基因组dna或重组dna；所述核酸分子也可以是rna，如mrna或hnrna等；

32、b2)含有b1)所述核酸分子的表达盒、重组载体、重组细胞或重组微生物。

33、该生物材料与上面所述的抗体或抗体片段或变体相关，比如可以用来产生上面所述的抗体或抗体片段或变体。

34、在一些实施方案中，本发明提供包含如下1)或2)或3)所示的分子：

35、1)如下核酸片段：

36、seq id no:1中第91-108位所示的核酸片段；

37、seq id no:1中第148-192位所示的核酸片段；

38、seq id no:1中第292-327位所示的核酸片段；

39、seq id no:2中第73-114位所示的核酸片段；

40、seq id no:2中第160-177位所示的核酸片段；

41、seq id no:2中第271-303位所示的核酸片段；

42、seq id no:1所示的核酸片段；

43、seq id no:2所示的核酸片段；

44、seq id no:73所示的核酸片段；或

45、seq id no:74所示的核酸片段；

46、2)与1)限定的核酸片段杂交且编码上述任一项所述的抗体或抗体片段或变体的核酸片段；

47、3)与1)或2)限定的核酸片段具有90％以上的同一性且编码上述任一项所述的抗体或抗体片段或变体的核酸片段。

48、上述核酸分子可用于上述的生物材料的一部分。

49、这里使用的术语“同一性”可以用肉眼或计算机软件(比如ausubel et al.eds.(2007)在current protocols in molecular biology中所述的软件程序)进行评价。当被比较的序列中的位置被相同的碱基或氨基酸占据时，则分子在该位置是同一的。两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。多聚核苷酸序列或氨基酸序列与另一序列有具有一定百分比(例如90％、95％、98％或者99％)的“序列同一性”是指当序列比对时，所比较的两个序列中该百分比的碱基或氨基酸相同。

50、在一些实施方案中，用抗pd-1抗体或抗体片段治疗可与放疗组合。放疗诱导癌细胞死亡，并增加用于呈递和激活免疫细胞的肿瘤抗原的有效性。

51、在另一些实施方案中，用抗pd-1抗体或抗体片段治疗可与手术组合以从受治疗者中去除癌细胞。

52、在其它实施方案中，抗pd-1抗体或抗体片段可与能同pd-1阻断产生协同作用的疗法组合，所述疗法包括用于激素消除或抑制血管生成的靶向药物，或靶向在肿瘤细胞中具有活性的蛋白质的靶向药物，所有这些均导致肿瘤细胞死亡增加和免疫刺激性肿瘤抗原的有效性提高。在与抗pd-1抗体或抗体片段联合的情况下，t细胞活化作用的提高可导致对癌症的持久免疫控制。

53、在一些实施方案中，抗pd-1抗体或抗体片段可与用于治疗癌症或感染性疾病的另一种治疗性抗体联合。提供的非限制性方案为抗pd-1与靶向her2/neu或靶向egf受体的抗体的组合。在另一个非限制性方案中，抗pd-1抗体或抗体片段与靶向vegf或其受体的治疗组合。在另一个实施方案中，抗pd-1抗体或抗体片段与抗ctla-4抗体组合。在又一个非限制性方案中，抗pd-1抗体与靶向rsv的抗体组合。

54、在本发明的另一个方面，还提供制备上述任一所述的抗体或抗体片段或变体的方法，所述方法包括：

55、a.在能使编码上述任一抗体或抗体片段或其变体的核酸分子表达的条件下于培养基中培养含有所述核酸分子的重组细胞，以制备所述抗体或抗体片段或变体。

56、在一些实施方案中，所述方法还包括：

57、b.从所述重组细胞或培养基中回收所述抗体或抗体片段或变体。

58、在本发明的另一个方面，还提供上述任一项所述的抗体或抗体片段或变体在制备如下任一所示的产品中的应用：

59、(1)检测pd-1的产品；

60、(2)刺激或提高免疫应答的产品；

61、(3)治疗癌症的产品。

62、在一些实施方案中，检测pd-1的产品为检测hpd-1的产品，例如体外检测hpd-1在特定的细胞、组织或血清中的表达的产品，或体内检测hpd-1的产品。

63、在一些实施方案中，在刺激或提高免疫应答的产品中，免疫细胞与抗原和所述抗体或抗体片段或变体接触，以便提高刺激或提高对抗原的免疫应答。

64、在一些实施方案中，所述免疫应答是t细胞介导的免疫应答。

65、在一些实施方案中，在治疗癌症的产品中，所述癌症为黑素瘤(例如恶性转移性黑素瘤)、肾癌(例如透明细胞癌)、前列腺癌(例如激素难控制的前列腺腺癌)、胰腺腺癌、乳腺癌、结肠癌、肺癌(例如非小细胞肺癌)、食道癌、头颈鳞状细胞癌、肝癌、卵巢癌、宫颈癌、甲状腺癌、胶质母细胞瘤、神经胶质瘤、白血病、淋巴瘤和其它恶性肿瘤。

66、在本发明的另一个方面，还提供一种药物组合物，其包含上述任一项所述的抗体或抗体片段或变体作为治疗活性成分以及药学上可接受的赋形剂、稀释剂或载体或它们的混合物。

67、在本发明的另一个方面，还提供治疗癌症比如上述癌症的方法，该方法包括对需要其的个体给予有效剂量的本发明所述的抗体或抗体片段或变体或药物组合物，所述个体可以是(比如)啮齿目动物、犬科动物、猪、灵长目动物或人。

68、在一些实施方案中，本发明提供的抗体或抗体片段与hpd-1结合并表现出较多优良特性，这些特性包括以下方面：

69、1、本发明提供的抗体或抗体片段与hpd-1高亲和力结合，可调控免疫应答。具体地，本发明的抗体或抗体片段可以以约20pm或更低的kd结合hpd-1。

70、2、本发明提供的抗体或抗体片段可以以约1.98×106 1/ms或更快的k结合结合hpd-1。

71、3、本发明提供的抗体或抗体片段可以以约4.11×10-5 1/s或更慢的k解离结合hpd-1。可用生物膜层光学干涉测量法(例如fortebio octet法)来测量解离常数，也可以用表面等离子共振技术(例如biacore)来测量解离常数。

72、4、本发明提供的抗体或抗体片段还可以以约1nm或更低的ic50阻断hpd-l1与hpd-1的结合。可用本领域任何已知的方法测量配体结合的阻断情况并计算ic50，例如facs法。

73、5、本发明提供的抗体或抗体片段可以通过阻断hpd-1与hpd-l1的结合来破坏hpd-1/hpd-l1介导的下游信号通路。