紫花苜蓿MYB转录因子MsMYB306基因及其应用

本发明属于植物基因工程领域，具体涉及紫花苜蓿myb转录因子msmyb306基因及其应用。

背景技术：

1、在农业生产过程中，如何提高产量尤为重要。非生物胁迫严重影响农业生产的产量。其中苜蓿种植地区主要分布在我国维度较高的地区，往往会遭遇低温胁迫，严重限制了苜蓿的产量。因此挖掘调控紫花苜蓿耐寒性的基因十分必要。

2、转录因子是指能够和真核基因启动子区域中顺式作用元件发生特异性相互作用的dna结合蛋白或能够与这些蛋白发生相互作用的相关蛋白质，即指能够特异性的激活或抑制转录的关键因子。大多数植物myb基因编码r2r3型myb蛋白质。r2r3-myb转录因子具有n末端dna结合结构域(myb结构域)和位于c末端的激活或抑制结构域。与高度保守的myb结构域相反，r2r3-myb蛋白的其他区域是高度可变的(jiang et al.,2004)。大量研究表明r2r3-myb转录因子参与多种过程，包括初级和次级代谢、植物发育以及对生物和非生物胁迫的响应(dubos et al.,2010)。

3、低温胁迫通过严重影响植物代谢和基因转录，阻碍植物的生长和发育。冷刺激植物快速诱导cbfs基因的表达，以激活许多下游cor基因(liu et al.,2018)。myb转录因子因其对cbfs基因的调节而被认为在调控耐寒性中起关键作用。在拟南芥中，myb15是cbfs基因的负调控因子。myb15突变体植物表现出对低温的耐受性增强，而过表达myb15的转基因植物表现出冷敏感表型。myb15通过直接结合cbfs启动子中的myb结合位点来抑制cbfs基因的表达(agarwal et al.,2006)。myb96受低温上调表达，通过正调节cbfs表达来提高拟南芥的抗冻性(guo et al.,2013)。在水稻中，osmybs3通过抑制cbfs基因的表达，抑制水稻早期对低温胁迫的响应，另一方面，osmybs3可以激活长期低温信号，调控海藻糖代谢途径中编码海藻糖-6-磷酸酯酶tpps(6-phosphate phosphatase)基因的表达来抵御长期低温胁迫(su et al.,2010)。在苹果中，mdmyb2和mdsiz1启动子的相互作用显著提高了植物对冷胁迫的耐受性(jiang et al.,2022)。过表达mdmyb4d的转基因苹果愈伤组织在冻害胁迫下电导率下降，存活率提高，正调控苹果愈伤组织的耐寒性(wu et al.,2017)。mdmyb23直接结合mdcbf1和mdcbf2启动子并激活其表达来提高耐寒性(an et al.,2018)。mdmyb88和mdmyb124分别结合mdcsp3(cold shock domain protein 3)和mdcca1(circadian clockassociated 1)的启动子，共同激活mdcbf3的表达，同时间接促进花青素积累以清除ros积累，从而正向调控苹果的耐寒性(xie et al.,2018)。在辣椒中，camyb306抑制了耐寒正调节因子cacipk13的转录负调控耐寒性(ma et al.,2022)。然而，有关于苜蓿中myb转录因子调控耐寒性功能鲜有报道，在蒺藜苜蓿中发现了调控mtcbf4的转录增强子mtmyb61和转录抑制子mtmyb3，mtmyb61与mtmyb3互作，削弱mtmyb3结合mtcbf4的启动子的能力，从而抑制mtcbf4下游靶基因mtcas15的表达，负调控蒺藜苜蓿的耐寒性(zhang et al.,2016)。综上所述，r2r3-myb转录因子家族成员在紫花苜蓿中是否还存在调控耐寒性的功能有待进一步研究。

4、紫花苜蓿是重要的豆科牧草，具有生物量高、营养品质好、栽培范围广等特点。然而低温严重限制了紫花苜蓿的生长发育和地理分布，并降低了产量和品质。从紫花苜蓿中克隆调控耐寒基因，能为紫花苜蓿转基因育种提供更为优良的目的基因，而且对于其他豆科作物的耐寒分子育种尤为重要。

技术实现思路

1、为克服现有技术的缺点和不足，本发明的首要目的是提供一种干涉其表达提高植物耐寒性的紫花苜蓿myb转录因子msmyb306基因。

2、本发明的另一目的在于提供上述紫花苜蓿myb转录因子msmyb306基因编码的蛋白。

3、本发明的再一目的在于提供上述紫花苜蓿myb转录因子msmyb306基因的应用。

4、本发明的目的通过下述技术方案实现：

5、第一方面，本发明请求保护一种紫花苜蓿myb转录因子myb306基因，该myb转录因子myb306基因的核苷酸序列为如下(1)或(2)：

6、(1)如seq id no.1所示的核苷酸序列；

7、(2)与(1)所述的核苷酸序列具有90％以上的同源性且具有同等功能的核苷酸序列。

8、第二方面，本发明请求保护上述紫花苜蓿myb转录因子myb306基因编码的蛋白，该蛋白的氨基酸序列为如下(a)或(b)：

9、(a)如seq id no.2所示的氨基酸序列；

10、(b)由seq id no.2所示的氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或几个氨基酸而形成的具有同等功能的序列。

11、第三方面，本发明请求保护与上述紫花苜蓿myb转录因子myb306基因相关的生物材料，该生物材料为含有所述myb转录因子myb306基因的生物材料，或者用于沉默、干扰或抑制所述myb转录因子myb306基因的生物材料；

12、所述的含有所述myb转录因子myb306基因的生物材料为如下(a)～(g)中的至少一种：

13、(a)含有所述myb转录因子myb306基因的表达盒；

14、(b)含有所述myb转录因子myb306基因的重组载体；

15、(c)含有(a)所述表达盒的重组载体；

16、(d)含有所述myb转录因子myb306基因的重组微生物；

17、(e)含有(a)所述表达盒的重组微生物；

18、(f)含有(b)所述重组载体的重组微生物；

19、(g)含有(c)所述重组载体的重组微生物；

20、所述的用于沉默、干扰或抑制所述myb转录因子myb306基因的生物材料为如下(ⅰ)～(ⅳ)中的至少一种：

21、(ⅰ)所述myb转录因子myb306基因的干扰序列；

22、(ⅱ)用于扩增(ⅰ)所述myb转录因子myb306基因干扰序列的引物组；

23、(ⅲ)所述myb转录因子myb306基因的干扰载体；

24、(ⅳ)含有如(ⅲ)所述干扰载体的重组微生物。

25、进一步，所述的用于扩增(ⅰ)所述myb转录因子myb306基因干扰序列的引物组包括msmyb306干涉片段正义链扩增上下游引物和msmyb306干涉片段反义链酶切位点的上下游引物；

26、msmyb306干涉片段正义链扩增上游引物y5288：

27、5’-accatggggcgcgcctggccaaacaagccttatctga-3’；

28、msmyb306干涉片段正义链扩增下游引物y5289：

29、5’-tcatcgattgggcgcgcctgctttgtgctccttcactaca-3’；

30、msmyb306干涉片段反义链酶切位点的上游引物y5290：

31、5’-cttaattaactctctagatggccaaacaagccttatctga-3’；

32、msmyb306干涉片段反义链酶切位点的下游引物y5291：

33、5’-ttgcaggtatttggatcctgctttgtgctccttcactaca-3’。

34、第四方面，本发明请求保护上述的紫花苜蓿myb转录因子myb306基因，上述的蛋白，或者上述的生物材料在以下(1)或(2)中的应用：

35、(1)提高植物耐寒性或培育耐寒性提高的转基因植物；

36、(2)降低植物耐寒性或培育冷敏感型转基因植物。

37、进一步，上述的应用，在目标植物中沉默或干扰上述的紫花苜蓿myb转录因子myb306基因提高植物的耐寒性。或者，在目标植物中过表达上述的紫花苜蓿myb转录因子myb306基因降低植物的耐寒性。

38、第五方面，本发明请求保护一种提高植物耐寒性的方法，在目标植物中沉默或干扰上述的紫花苜蓿myb转录因子myb306基因提高植物的耐寒性。

39、进一步，上述的方法为在目标植物中沉默或干扰上述的紫花苜蓿myb转录因子myb306基因的过程为：构建上所述紫花苜蓿myb转录因子myb306基因的干扰载体，通过农杆菌介导法将所述的干扰载体转入到植物中得到耐寒性提高的转基因植株。

40、本发明所述的植物为苜蓿。

41、研究过程中，技术人员分别采用pcambia3301和pfgc5941构建过表达载体35s::msmyb306和干扰载体msmyb306-rnai，筛选压均为草丁膦。选择扦插8-12周的紫花苜蓿成熟叶片进行遗传转化，依次进行侵染、共培养、愈伤组织的诱导、愈伤组织再生和再生苗生根等过程获得转基因紫花苜蓿。

42、含有紫花苜蓿myb转录因子msmyb306基因的重组载体为重组表达载体，该重组表达载体是通过将上述紫花苜蓿myb转录因子msmyb306基因的核苷酸序列与植物表达载体连接得到的；所述的植物过表达载体优选为pcambia3301。

43、制备干扰紫花苜蓿myb转录因子msmyb306基因表达的干扰载体，所采用的载体优选为pfgc5941；

44、含有紫花苜蓿myb转录因子msmyb306基因(msmyb306)的重组表达载体的制备方法，包含以下步骤：

45、(1)引物设计

46、引物①为msmyb306基因片段扩增上游引物y4752：

47、5’-atgatgggaaggccaccatgtt-3’；

48、引物②为msmyb306基因片段扩增下游引物y4753：

49、5’-ctaaaagaaatctgaagtagtt-3’；

50、引物③为msmyb306构建过表达载体扩增上游引物y4926：

51、5’-cacgggggactcttgaccatggcaatgatgggaaggccaccatgtt-3’；

52、引物④为msmyb306构建过表达载体扩增下游引物y4927：

53、5’-cggggaaattcgagctggtcaccctaaaagaaatctgaagtagtt-3’；

54、引物⑤为msmyb306干涉片段正义链扩增上游引物y5288：

55、5’-accatggggcgcgcctggccaaacaagccttatctga-3’；

56、引物⑥为msmyb306干涉片段正义链扩增下游引物y5289：

57、5’-tcatcgattgggcgcgcctgctttgtgctccttcactaca-3’；

58、引物⑦为msmyb306干涉片段反义链酶切位点的上游引物y5290：

59、5’-cttaattaactctctagatggccaaacaagccttatctga-3’；

60、引物⑧为msmyb306干涉片段反义链酶切位点的下游引物y5291：

61、5’-ttgcaggtatttggatcctgctttgtgctccttcactaca-3’；

62、(2)msmyb306基因片段的获得：

63、以紫花苜蓿的cdna为模板，使用引物①和引物②扩增msmyb306基因全长片段；

64、(3)含有msmyb306基因的重组表达载体pcambia3301-msmyb306和pfgc5941-msmyb306的构建：

65、以msmyb306基因片段为模板，使用引物③和引物④使msmyb306基因片段引入ncoi和bste ii两个酶切位点，并与植物表达载体pcambia3301连接，进而构建获得含有msmyb306基因的重组表达载体pcambia3301-msmyb306；

66、以msmyb306基因片段为模板，使用引物⑤和引物⑥使msmyb306基因干涉正义片段引入含有asc i酶切位点的同源臂，使用引物⑦和引物⑧使msmyb306基因干涉反义片段引入含有xba i和bamh i酶切位点的同源臂，将正义片段先与植物表达载体pfgc5941连接，然后将反义片段与已经连接上正义片段的载体连接，进而获得含有msmyb306干涉片段的重组表达载体pfgc5941-msmyb306；

67、含有msmyb306基因的重组表达载体pcambia3301-msmyb306的转基因植株和pfgc5941-msmyb306干扰载体的转基因植株是通过将上述重组表达载体或干扰载体转化紫花苜蓿叶片组织，并将转化的植物组织培养得到的。

68、本发明的具体实施方式中，所述的植物优选为紫花苜蓿。

69、所述表达紫花苜蓿msmyb306的转基因植株的制备方法，包含如下步骤：

70、(1)用电击转化的方法将重组表达载体pcambia3301-msmyb306和干扰载体pfgc5941-msmyb306导入根瘤农杆菌eha105中，分别获得含有重组表达载体pcambia3301-msmyb306和干扰载体pfgc5941-msmyb306的农杆菌阳性菌落；

71、(2)将活化的含有重组表达载体pcambia3301-msmyb306和干扰载体pfgc5941-msmyb306的农杆菌eha105浸染紫花苜蓿的叶片，经共培养和草丁膦抗性筛选，获得转基因紫花苜蓿。

72、本发明从紫花苜蓿中克隆了myb转录因子的cdna序列msmyb306，并将获得的msmyb306基因的正义片段和反义片段与植物表达载体连接，构建了过表达载体和干扰载体，用构建的过表达载体和干扰载体转化紫花苜蓿叶片，然后培育成转基因紫花苜蓿。msmyb306基因受低温诱导下调表达；本发明提供了利用msmyb306基因调控植物耐寒性的方法，将该基因在紫花苜蓿中过量表达后，降低了转基因苜蓿的耐寒性；同时，将该基因在紫花苜蓿中干扰后，提高了转基因苜蓿的耐寒性。

73、本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

74、(1)本发明从紫花苜蓿中克隆了msmyb306的cdna序列，该基因的表达受低温的诱抑制下调表达。

75、(2)本发明将获得的msmyb306的cdna全长与植物过表达载体连接，构建了适合于紫花苜蓿的过表达载体，将获得的msmyb306基因的正义片段和反义片段与植物干扰载体连接，构建了适合于紫花苜蓿的干扰表达载体，并转化紫花苜蓿，过表达msmyb306的转基因紫花苜蓿明显降低了耐寒性，干扰msmyb306表达的转基因紫花苜蓿明显提高了耐寒性。

76、(3)本发明提供了利用rnai干扰技术下调msmyb306表达培育耐寒紫花苜蓿的方法。

77、(4)本发明提供了利用msmyb306基因培育耐逆境植物的方法。