一种人工蛋白及其应用的制作方法

本发明属于人工蛋白，具体涉及一种人工蛋白及其应用。

背景技术：

1、肿瘤的发生是由于机体细胞分裂过程中产生基因突变，突变细胞的生长失去控制的结果。如果肿瘤细胞不能在短期内被清除，持续的抗原刺激会逐渐造成肿瘤抗原特异性t细胞的功能性衰竭，形成对肿瘤的耐受，免疫系统对肿瘤细胞不再敏感，造成肿瘤进一步的生长和扩散，最终形成癌症。由病毒感染导致慢性疾病的发生也是抗原特异性细胞衰竭的结果，众多研究已经证明了这个结论。

2、研究还表明，由于持续地抗原刺激，大部分肿瘤侵润性淋巴细胞(til)和抗病毒特异性t细胞都高表达免疫抑制性受体，处于功能性衰竭状态，减弱或丧失了特异性识别与杀伤抗原阳性靶细胞的功能。衰竭性免疫细胞丧失分泌功能性细胞因子的能力，如伽马干扰素(ifnγ)等。即使机体内存在大量的特异性免疫细胞，衰竭的免疫细胞也不能清除抗原阳性靶细胞。在表型上，衰竭性t细胞普遍高表达的免疫抑制检查点受体包括程序性死亡受体(pd-1)，程序性死亡配体(pd-l1/l2)，t细胞免疫球蛋白3(tim-3)，细胞毒t淋巴细胞抗原4(ctla-4)和淋巴细胞活化基因3(lag-3)等。这些信号通路的激活会通过诱导磷酸酶抑制磷酸化反应，消弱免疫细胞活化信号，抑制免疫细胞的扩增，降低效应免疫细胞的功能，促进t细胞的凋亡，引起免疫耐受。所以，激活这一类抗原特异性的免疫细胞群体，让他们重新恢复杀灭抗原阳性靶细胞的功能，才能清除肿瘤细胞或病毒感染细胞，最终达到治愈的目的。

3、抗体可以特异性地识别靶细胞表面的蛋白抗原，检查点抑制性抗体可以阻抑衰竭性细胞表面的免疫抑制性信号，例如通过pd-1抗体(pembrolizumab和nivolumab)与pd-1的结合防止抑制性信号的传导与激活，恢复衰竭性免疫细胞的功能，已经在临床上显示治疗癌症的临床效果，尤其是在部分患者身上得到了肿瘤完全消失和较长的临床效果持续性。但是，对缺乏效应细胞的患者临床效果还不理想，而且这种t细胞的恢复持续时间较短，患者体内的特异性免疫细胞又会很快重新回到衰竭状态。同时，只是阻断t细胞抑制信号不会导致免疫细胞数量的增加，而缺乏免疫效应细胞的患者基本上又不会产生临床效果，所以进一步限制检查点抗体的临床治疗效果。

4、细胞因子已经被批准用于癌症治疗，interleukin-2(il-2)在1992年被批准用于结直肠癌治疗。但是，只有少部分患者受益，同时，大部分患者会有严重的副作用。高剂量的il-2会造成患者休克甚至死亡，最后，应用il-15治疗肿瘤的临床试验也没有产生明显的临床效果。

5、cd137是t细胞受刺激后表达一个tnfr受体.cd137-cd137l的相互作用可以引起免疫细胞扩增和生存，增强免疫细胞功能，防止免疫细胞凋亡。在抗原刺激性细胞中，cd137能促进抗原递呈细胞的功能，增强对t细胞的激活作用。实验证明，cd137分子的激活，可以增加抗原特异性免疫细胞的活性。动物实验表明，只有cd137+的免疫细胞才有控制肿瘤生长的作用。近几年，cd137+t细胞控制肿瘤患者恶化得到进一步证明，其在肿瘤微环境中的表达可能受到pd-1抑制而活性降低。临床研究表明，cd137在淋巴细胞中的表达与节直肠癌患者的生存成正相关。再者，在肺癌患者中，cd137+细胞的减少和患者的生存呈反向关系。同时，cd8+cd137+阳性t细胞的比例与癌症患者的生存率呈明显正相关性，高比例的cd3+cd137+pd1+免疫细胞明显减少患者恶化的机率。

6、综合上述证明，截止目前，本领域中还没有一种既能针对性地识别衰竭性免疫细胞，又能增加免疫细胞功能的蛋白药物。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种人工蛋白及其应用，所述人工蛋白既能够衰竭性免疫细胞又能增强免疫细胞的功能。

2、本发明提供了一种人工蛋白，所述人工蛋白包括识别功能区、激活功能区和连接所述识别功能区和激活功能区的非功能性氨基酸片段；所述识别功能区的c端与所述激活功能区的n端通过非功能性氨基酸片段进行连接；

3、所述识别功能区包括pd-1单链抗体，所述pd-1单链抗体的氨基酸如seq id no.1所示，或与seq id no.1所示氨基酸具有相同功能的突变体序列；

4、所述激活功能区包括细胞因子il-2、il-7、il-15或il-21。

5、优选的，所述细胞因子il-2的氨基酸序列如seq id no.2所示，或与seq id no.2所示氨基酸具有相同功能的突变体序列；

6、所述细胞因子il-7的氨基酸序列如seq id no.3所示，或与seq id no.3所示氨基酸具有相同功能的突变体序列；

7、所述细胞因子il-15的氨基酸序列如seq id no.4所示，或与seq id no.4所示氨基酸具有相同功能的突变体序列；

8、所述细胞因子il-21的氨基酸序列如seq id no.5所示，或与seq id no.5所示氨基酸具有相同功能的突变体序列；

9、优选的，所述非功能性氨基酸片段的氨基酸序列如seq id no.6所示。

10、优选的，所述人工蛋白的氨基酸序列如seq id no.7、seq id no.8、seq id no.9或seq id no.10所示。

11、本发明还提供了上述技术方案所述人工蛋白在制备恢复免疫细胞功能的药物中的应用。

12、优选的，所述免疫细胞包括t细胞和/或nk细胞。

13、优选的，所述药物包括同时识别衰竭性免疫细胞和/或增强免疫细胞功能的药物。

14、优选的，所述药物包括治疗癌症和/或慢性病毒感染的药物。

15、优选的，所述癌症包括肾细胞癌、黑色素瘤、淋巴瘤、结直肠癌，肝癌、头颈部鳞癌、膀胱癌和肺癌中的一种或多种。

16、本发明还提供了一种恢复免疫细胞功能的药物，所述药物包括上述技术方案所述的人工蛋白。

17、有益效果：

18、本发明提供了一种人工蛋白，所述人工蛋白包括识别功能区、激活功能区和连接所述识别功能区和激活功能区的非功能性氨基酸片段；所述识别功能区的c端与所述激活功能区的n端通过非功能性氨基酸片段进行连接；所述识别功能区包括pd-1单链抗体，所述pd-1单链抗体的氨基酸如seq id no.1所示；所述激活功能区包括细胞因子il-2、il-7、il-15或il-21。本发明所述人工蛋白具有独特的体内外免疫活性，而且能够满足恢复患者免疫功能的需要；即所述人工蛋白结构既能识别衰竭的免疫细胞，又能增加侵袭性，恢复其功能；且其临床应用可以增强抑制肿瘤生长和控制病毒感染的功能，具有很好的临床前景和广泛的应用范围。

技术特征：

1.一种人工蛋白，其特征在于，所述人工蛋白包括识别功能区、激活功能区和连接所述识别功能区和激活功能区的非功能性氨基酸片段；所述识别功能区的c端与所述激活功能区的n端通过非功能性氨基酸片段进行连接；

2.根据权利要求1所述的人工蛋白，其特征在于，所述细胞因子il-2的氨基酸序列如seq id no.2所示，或与seq id no.2所示氨基酸具有相同功能的突变体序列；

3.根据权利要求1或2所述的人工蛋白，其特征在于，所述非功能性氨基酸片段的氨基酸序列如seq id no.6所示。

4.根据权利要求1所述的人工蛋白，其特征在于，所述人工蛋白的氨基酸序列如seq idno.7、seq id no.8、seq id no.9或seq id no.10所示。

5.权利要求1～4任一项所述人工蛋白在制备恢复免疫细胞功能的药物中的应用。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述免疫细胞包括t细胞和/或nk细胞。

7.根据权利要求5或6所述的应用，其特征在于，所述药物包括同时识别衰竭性免疫细胞和/或增强免疫细胞功能的药物。

8.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述药物包括治疗癌症和/或慢性病毒感染的药物。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述癌症包括肾细胞癌、黑色素瘤、淋巴瘤、结直肠癌，肝癌、头颈部鳞癌、膀胱癌和肺癌中的一种或多种。

10.一种恢复免疫细胞功能的药物，其特征在于，所述药物包括权利要求1～4任一项所述的人工蛋白。

技术总结
本发明属于人工蛋白技术领域，具体涉及一种人工蛋白及其应用。本发明所述人工蛋白具有独特的体内外免疫活性，而且能够满足恢复患者免疫功能的需要；即所述人工蛋白结构既能识别衰竭的免疫细胞，又能增加侵袭性，恢复其功能；且其临床应用可以增强抑制肿瘤生长和控制病毒感染的功能，具有很好的临床前景和广泛的应用范围。

技术研发人员：岳喜连
受保护的技术使用者：岳喜连
技术研发日：
技术公布日：2024/3/4