一种基于RecET重组系统的类球红细菌基因编辑方法及其应用

本发明属于生物，更具体地，本发明涉及一种基于recet重组系统的类球红细菌基因编辑方法及其应用。

背景技术：

1、氢能是一种清洁、安全、高效、可持续的能源，被视为21世纪最具发展潜力的新兴能源，是未来能源主体的战略发展方向。生物制氢可通过暗发酵、光发酵、生物光解和微生物电解池等多种方法进行，其中最有效、最快捷的技术是利用太阳能。植物、藻类和光合微生物具有将太阳能转化为生物氢的潜力，称为光发酵制氢技术。通常用于光发酵生物制氢的光发酵微生物的主要类别包括紫色非硫(pns)细菌。紫色非硫光合细菌表现出高度的代谢灵活性，可以作为光异养、光自养或趋化异养生长。

2、类球红细菌(rhodobacter sphaeroides)是一种革兰氏染色阴性的，紫色非硫不产氧光合细菌，是研究光合作用的的模式菌株，属于α变形杆菌门。因其独特的代谢模式以及光合系统的构造，类球红细菌可用于生物制氢。另外其旺盛的卟啉代谢途径和光合系统能衍生多条相关途径化合物的生产，如粪卟啉、血红素、叶绿素以及辅酶q10和萜类，还被用于生物产氢等工业应用，是一种极具有工业生产价值的高潜力底盘菌株。

3、然而，在菌株中，对于途径的改造通常涉及基因敲除、替换和修饰等编辑，需要省时高效的基因编辑方法。目前基于pk18自杀质粒介导的同源重组，完全依赖于体内自发的同源双交换重组过程，是一种效率较低的方法。具体体现在，需提供500～1000bp的同源片段，至少需要单交换筛选和双交换筛选两个以上细胞生长周期，且筛选双交换阳性率低，通常需要筛选数十个以上的转化子才能成功获得重组子，是一种效率低、时间长的方法。

4、另外，目前在类球红细菌中开发的crispr/cas相关的基因编辑方法虽然也有将编辑周期缩短至一个生长周期，但是这类方法通常需要再次构建含有grna的质粒，而且仍然需要提供500～1000bp的同源片段作为修复模板，仍然是一种比较繁琐的方法。

5、因此，本领域非常有必要开发一种适用于类球红细菌的、简易高效的基因编辑方法。来自噬菌体的recet重组系统是一种依赖短同源片段即可实现同源重组的基因编辑方法。然而，recet具有严谨的种属特异性。例如，研究证明来自大肠杆菌的lambda red或recet重组系统只能在大肠杆菌以及近缘的几个种中高效介导重组，在远缘物种中不表现重组活性。所以需要通过生物信息学手段，并通过实验验证的方法挖掘一组适用于类球红细菌的recet重组系统。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种可以在类球红细菌zx中基于recet重组系统的基因编辑方法及其应用，为类球红细菌提供一种高效简易的基因编辑方法。

2、在本发明的第一方面，提供一种利用对类球红细菌进行基因编辑的方法，包括：利用recet重组系统进行基因编辑；其中，所述recet重组系统包括：5’→3’外切酶parece，其具有seq id no:1所示的氨基酸序列；单链dna退火蛋白parect，其具有seq id no:2所示的氨基酸序列。

3、在一种或多种实施方式中，所述方法包括：

4、(1)提供用于表达recet系统的重组表达载体，包括外源的且操作性连接的：启动子，parece表达元件，parect表达元件，orit；

5、(2)提供同源重组表达盒，包括外源的且操作性连接的：5’目标基因同源臂、打靶基因、3’目标基因同源臂；其中，所述打靶基因用于替换类球红细菌中的目标编辑基因；较佳地，所述打靶基因为抗性筛选基因；

6、(3)将(1)的重组表达载体引入到类球红细菌中，获得表达recet系统的重组类球红细菌；

7、(4)将(2)的同源重组表达盒引入到(3)的类球红细菌中，使得目标编辑基因被打靶基因同源替换。

8、在一种或多种实施方式中，所述类球红细菌包括产氢类球红细菌、高产q10类球红细菌(发明人在先专利申请中)以及野生型类球红细菌。

9、在一种或多种实施方式中，所述用于表达recet系统的重组表达载体还包括操作性连接的元件：抗性筛选基因(如kanr)，repa，ori，抑制子laclq。

10、在一种或多种实施方式中，通过接合转移的方法将(1)的重组表达载体引入到类球红细菌中。

11、在一种或多种实施方式中，通过电转的方法将(1)的重组表达载体引入到类球红细菌中。

12、在一种或多种实施方式中，通过电转的方法将(2)的同源重组表达盒引入到(3)的类球红细菌中。

13、在一种或多种实施方式中，所述的基因编辑针对类球红细菌的基因组或游离基因(如位于游离质粒上的基因)。

14、在一种或多种实施方式中，所述5’目标基因同源臂或3’目标基因同源臂长度40～170bp；较佳地为50～160bp；更佳地为55～150bp(如58、60、65、70、80、90、100、120、140、160bp)。

15、在一种或多种实施方式中，所述启动子为诱导型启动子或组成型启动子；较佳地，所述启动子为诱导型启动子；更佳地，所述诱导型启动子包括：iptg诱导型启动子，如pa1/04/03启动子、plac启动子；阿拉伯糖诱导型启动子，如pbad启动子。

16、在一种或多种实施方式中，所述iptg诱导型启动子为pa1/04/03启动子，在受到iptg诱导后，驱动其下游基因的表达，从而表达parece和parect。

17、在一种或多种实施方式中，步骤(3)中，将(1)的重组表达载体引入到类球红细菌中时，采用电转化的方法；较佳地，电转化中，电击细胞并加入培养基的时候，还加入mgcl2，孵育；较佳地，所述mgcl2在培养基中的终浓度2～40mm，更佳地3～35mm(如4mm，5mm，8mm，10mm，15mm，20mm，25mm，30mm，35mm，40mm)。

18、在本发明的另一方面，提供组合的5’→3’外切酶parece以及单链dna退火蛋白parect的用途，用于建立recet重组系统，对类球红细菌进行基因编辑；其中，所述5’→3’外切酶parece具有seq id no:1所示的氨基酸序列；所述单链dna退火蛋白parect具有seq idno:2所示的氨基酸序列。

19、在一种或多种实施方式中，所述的5’→3’外切酶parece以及单链dna退火蛋白parect由类球红细菌表达。

20、在一种或多种实施方式中，建立用于表达recet系统的重组表达载体，包括外源的且操作性连接的：启动子、parece表达元件、parect表达元件、orit，将该重组表达在途引入到类球红细菌进行表达。

21、在一种或多种实施方式中，利用同源重组表达盒来将打靶基因替换类球红细菌中的目标编辑基因；其中，所述同源重组表达盒包括外源的且操作性连接的：5’目标基因同源臂、打靶基因、3’目标基因同源臂；其中，所述打靶基因用于替换类球红细菌中的目标编辑基因；更佳地，所述5’同源臂或3’同源臂长度40～170bp；较佳地为50～160bp；更佳地为55～150bp(如58、60、65、70、80、90、100、120、140、160bp)。

22、在本发明的另一方面，提供一种重组的类球红细菌，其表达recet重组系统；所述recet重组系统包括：5’→3’外切酶parece，其具有seq id no:1所示的氨基酸序列；单链dna退火蛋白parect，其具有seq id no:2所示的氨基酸序列。

23、在一种或多种实施方式中，所述recet重组系统如下表达：(a)提供用于表达recet系统的重组表达载体，包括外源的且操作性连接的：启动子，parece表达元件，parect表达元件，orit；(b)将(a)的重组表达载体引入到类球红细菌中，获得表达recet系统的重组类球红细菌。

24、在本发明的另一方面，提供所述的重组的类球红细菌的用途，用于作为基因编辑的受体菌株，所述基因编辑为基于recet重组系统的基因编辑。

25、在本发明的另一方面，提供一种用于进行基因编辑的试剂盒，其中包括：所述的重组的类球红细菌；以及，同源重组表达盒，包括外源的且操作性连接的：5’目标基因同源臂、打靶基因、3’目标基因同源臂；其中，所述打靶基因用于替换类球红细菌中的目标编辑基因；较佳地，所述5’同源臂或3’同源臂长度40～170bp；较佳地为50～160bp；更佳地为55～150bp(如58、60、65、70、80、90、100、120、140、160bp)。

26、在一种或多种实施方式中，所述试剂盒中还包括细胞培养基以及mgcl2；更佳地，试剂盒中所述mgcl2的量为能在培养基中形成终浓度2～40mm，更佳地3～35mm(如4mm，5mm，8mm，10mm，15mm，20mm，25mm，30mm，35mm，40mm)的量。

27、本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。