沙葱萤叶甲GdBR-C基因及其在RNAi介导的害虫防治方面的应用

本发明涉及基因工程，更具体的说是涉及沙葱萤叶甲gdbr-c基因及其在rnai介导的害虫防治方面的应用。

背景技术：

1、沙葱萤叶甲galeruca daurica是近些年来肆虐危害草原植被的一种新害虫，属鞘翅目coleoptera、叶甲科chrysomelidae、萤叶甲亚科galerucinae，该虫分布广泛，在国内和国外均有发生，在国内主要分布在北部及西北部(内蒙古、新疆、甘肃等)，在国外分布在俄罗斯西伯利亚、蒙古国和朝鲜、韩国这些国家。该虫一年发生一代，属完全变态昆虫，一生要经历卵、幼虫、蛹及成虫四个生命阶段，属寡食类害虫，以百合科葱属类植物为食，幼虫和成虫皆可取食为害。该虫于四月中上旬以越冬卵的状态孵化，四月下旬至五月中为幼虫期，呈带状分布为害植被；于六月上旬羽化为成虫，取食约一周后躲藏在石块、牛粪及杂草下不食不动，从而抵御不利环境进入滞育期，在8月下旬滞育期解除，成虫开始活动取食，并开始进行交配产卵，后又以滞育卵开始越冬。该虫自09年在内蒙古锡林郭勒草原突然大爆发后，危害趋势逐年加重。草场植被遭受取食后，草地破坏严重，植被紧缺，土壤结构受损，致使牧草数量和质量急剧下降，草原生态受到恶劣影响，降低了农牧民的经济效益，严重威胁了草原的可持续发展。

2、沙葱萤叶甲的发生危害已经严重影响到草原的生态环境质量，目前对于沙葱萤叶甲的防治主要以印楝素、苦参碱等植物源农药掺杂化学农药为主，但此种方法靶向性较差，在防治该虫的同时杀伤天敌昆虫和中性昆虫，严重破坏草原生态系统的生物多样性。此外，农药残留会对草原牲畜放牧安全造成一定威胁，给牧民带来巨大经济损失。

3、因此，迫切需要开发一种沙葱萤叶甲绿色防控新技术。核酸农药具备靶向性强、环境兼容性好等诸多优势，开发绿色环保的新型rna农药将在沙葱萤叶甲绿色防控技术中具有巨大的应用前景。但是目前关于沙葱萤叶甲的rna农药未见报道。

4、综上，如何提供一种沙葱萤叶甲的rna农药是本领域技术人员亟需解决的技术问题。

技术实现思路

1、有鉴于此，本发明提供了沙葱萤叶甲gdbr-c基因及其在rnai介导的害虫防治方面的应用。靶基因的筛选和挖掘是一项费时费力的工作，本发明以转录组测序为基础，并查阅大量相关文献，寻找沙葱萤叶甲生长发育相关基因。

2、本发明从沙葱萤叶甲中克隆获得了沙葱萤叶甲广谱复合物基因gdbr-c，通过双链rna注射法实现对gdbr-c基因的干扰，确定gdbr-c基因在沙葱萤叶甲变态发育中的重要作用。经表型观察，发现gdbr-c基因的缺失导致沙葱萤叶甲三龄幼虫化蛹异常，目前已经证明gdbr-c基因能够调控沙葱萤叶甲的变态发育过程。这一研究结果可以以gdbr-c基因为靶标，为开发利用新型rna农药来防治沙葱萤叶甲奠定必要的基础。

3、为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

4、沙葱萤叶甲gdbr-c基因，其核苷酸序列如seq id no:1所示。

5、atttttttgcgcgcttcaatttttaatatacgcccgaaactcgtgatgttctgacgaacggtccacaatagcacgattgcatttgtaatattcgcgaagtgtgactcatttatattttaactggaaacagtttttaaatttaccgcgttttttgtgtgttttcaaaacatctgtgtatcaaggcgcgaactcatcacacgatgttattctaacgtaatatggattctgcagagaaaatacaaacatttcaatgattatttttaatctcaggtgaattttatttacaatggtagatacacaacatttttgtctgcgttggaacaactatcagagcagcataacatcagctttcgaaaacctccgtgacgatgaagattttgtagatgttacgttagcctgtgatggaaaaagtttgaaggctcatcgagtggttttatcagcttgtagtccatattttagagaattactcaagagtacaccttgtaaacatccagtgatagtacttcaagatgtcgcttggacggacttgcacgcattggtcgagttcatttatcacggagaagttaatgtacatcaacgttccctctcgtcattccttaaaacggcagaagtcctcagggttagcggtctcacacaacaacacggagatggtcgagaacagttggcacaagtacaaagtatggtcagatcacagcaacattcgacgccagtctccaaccaccattcaacgtttacggataagctagtagaagatagtttgttcacgtctccttcctcccctccccatggcgctactgtcaatcaattgctcaggagagccgcattgcaatacaggagagagagaaggatatcaatggatccagataatgaacataaaaggacaagaattgatcacattatgggcaataacaataataataacaacaataataatgaattaaatttatcgacgacgcattcgcaacacctcccacctcagacgcaaccagcagacttttcccctagcgctatgaaaaataacgtgctcaatctcaatcttaattcaataaaaaccgatacagaagttaataatggtataagtagtacggatcgagaagcttcaccgtgttcgccgtcccccactctcctccattcccgatgtaataacaacgacaacgataacaacaacattaaaaatgaacccatagaattgctctgtaataccaaccaagacgacaacagcaacgactcagccgacatgaccaacgataatgggggcagtgggcctcatggcggacctctttcgggtagctcggggggcggcggggaccacgacgatcatgatagcgctataagtccttatttaacgccgacggaaagcaagttatttgctacggcggcgggaagttttaattttagtatggcggcgctagcgggtgatacttctatgttaggaggattgaatcagtctctacagggaaacgacagtttggctgggacttcccaagccgaacgtcgtctcagtttccccctccctttgaacgccagccaccgatgtgacgtttgcggcaagctactcagcaccaaactaaccctcaaacggcataaggagcagcagcatctccagccgttgaacagtgcagtctgctgtctttgccggaaagtgtttcgaactttaaattcgctgaataaccacagaagcatttatcataggaggcagaaagacattcataataataatccgcctgttaagcccccgctctgattctttttagtttctattttagactagacgatgttttagaaatgtttttcttaaacataaacaggtagcaaaaggacattatgacggtgaatccagagaataatagtttttgtaacattgaatcatatgagtaaaaacaacaaactgttcggcatcttcatgtttagtgcgaaatgtccgtaaataattattatagaattatacttcaatatttgtcaacaagaagtagttaaatgtaaacaaacacaaattcttaaaggaaattaaaacatatccttcgaaattgtaatccaattttaggaaattacaattctttcgacaagattttgaaaattattcattagtttgtcttcaaagttaaattttactgtcgtactcaaataaaatgaagagattcattctgttcattattggattcttactctcgaaaataagctccaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa，seq id no:1。

6、变态是昆虫生长发育过程中重要的生理行为。broad-complex(br-c)作为蜕皮激素信号通路的主要应答基因，在昆虫的生长发育中发挥重要的调控作用。20-羟基蜕皮酮(20e)信号通路会通过级联反应促使基因的表达从而调节蜕皮过程，而br-c基因则位于信号转导的初级应答阶段，在20e信号转导中占据重要地位，并且受到20e的调控。因此，广谱复合物br-c基因作为蜕皮激素通路中的关键调控因子，在昆虫的变态发育和生长发育过程中都发挥着极其重要的作用。

7、上述的沙葱萤叶甲gdbr-c基因在rnai介导的害虫防治方面的应用。

8、rna干扰技术(rna interference，rnai)首次被发现是1990年naploli等人在研究矮牵牛花的颜色中，对其进行了基因诱导，得到了与预想中完全相反的结果，自此，rnai技术开始被人们所研究。rnai是在生物内进行内源或外源的双链rna的诱导，使其体内的mrna与其进行特异性结合后，在转录后水平致使mrna降解，达到基因沉默的作用。rnai技术在生物体的基因功能研究和害虫防治等方面发挥着重大的作用。

9、进一步的，所述rnai介导中，合成的dsrna通过注射进入沙葱萤叶甲体内。

10、进一步的，所述dsrna的核苷酸序列如seq id no:2所示。

11、agacgcaaccagcagacuuuuccccuagcgcuaugaaaaauaacgugcucaaucucaaucuuaauucaauaaaaaccgauacagaaguuaauaaugguauaaguaguacggaucgagaagcuucaccguguucgccgucccccacucuccuccauucccgauguaauaacaacgacaacgauaacaacaacauuaaaaaugaacccauagaauugcucuguaauaccaaccaagacgacaacagcaacgacucagccgacaugaccaacgauaaugggggcagugggccucauggcggaccucuuucggguagcucggggggcggcggggaccacgacgaucaugauagcgcuauaaguccuuauuuaacgccgacggaaagcaaguuauuugcuacggcggcgggaaguuuuaauuuuaguauggcggcgcuagcgggugauacuucuauguuaggaggauugaaucagucucuacagggaaacgacaguuugg，seq id no:2。

12、进一步的，所述dsrna的合成步骤如下：

13、提取沙葱萤叶甲的总rna，反转录成为cdna作为扩增模板，以序列为seq id no:9的上游引物和以序列为seq id no:10的下游引物进行pcr扩增，pcr扩增产物进行电泳后回收产物，以胶回收产物为模板合成得到沙葱萤叶甲gdbr-c基因的dsrna。

14、经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明取得的有益效果为：核酸农药具备靶向性强、环境兼容性好等诸多优势，开发绿色环保的新型rna农药将在沙葱萤叶甲绿色防控技术中具有巨大的应用前景。本发明从沙葱萤叶甲中克隆获得了沙葱萤叶甲广谱复合物基因gdbr-c，通过双链rna注射法实现对gdbr-c基因的干扰，确定gdbr-c基因在沙葱萤叶甲变态发育中的重要作用，为开发利用新型rna农药来防治沙葱萤叶甲奠定必要的基础。