HCV核心抗原core的杂交瘤细胞DF2及单抗和应用的制作方法

本发明涉及检测领域，具体涉及hcv核心抗原core的杂交瘤细胞df2，还涉及由该杂交瘤细胞分泌的单抗和在制备检测试剂中的应用。

背景技术：

1、丙型肝炎(hepatitis c)是由丙型肝炎病毒(hcv)感染导致的一种肝脏疾病，人群普遍易感，80％的急性丙型肝炎患者会转为慢性感染，10～20％的慢性患者会发展为肝硬化、肝癌。目前对于丙型肝炎的治疗，多为采用聚乙二醇化干扰素(interferon，ifn)和利巴韦林，虽然有新药司美匹韦(simeprevir)、索非布韦(sofosbuvir)等上市，治疗效果显著提高，但其费用较高，且有一定的毒副作用，限制其进一步推广使用。因此，开发新的hcv检测技术，对hcv感染者早期及时诊断和治疗，提高血液制品安全，从根本上消除hcv的传播扩散十分重要。

2、hcv感染的诊断是丙型肝炎预防控制工作的重要组成部分，建立敏感实用的检测方法对于监测、诊断或血液筛查，控制hcv的流行显得尤为重要。目前检测hcv的方法有较多，总体来说可以分为抗体检测和病毒检测两大类，病毒检测包括核酸检测(nucleic acidtesting，nat)和核心抗原(core)检测。

3、抗-hcv抗体检测方法是最早确立的实验室诊断方法，目前已广泛用于临床诊断和无症状人群筛查。根据待检抗体出现的时间以及所使用的抗原不同，酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbnent assay，elisa)检测血清中的hcv抗体经历4次技术换代，第1～3代均是hcv抗原包被微孔板，辅以酶标鼠抗人igg单克隆抗体进行检测，而第4代检测技术使用hcv ns3/ns4双抗原夹心elisa进行检测，灵敏度和检出时间都有一定程度的改善。抗-hcv抗体检测虽然经济便捷、应用广泛，但它是间接血清学技术，存在较长的“窗口期”，即在hcv感染后2个月的时间里，感染者体内不能及时产生足以检测的特异抗体量，而此时的血液具有传染性。另外，hcv抗体检测无法区分患者处于急性、慢性和既往感染，也无法对临床疗效进行监测。

4、核酸扩增检测技术(nucleic acid testing，nat)为目前hcv感染的确诊手段，1999年欧盟开始采用nat对医用血浆进行hcv筛查，美国和日本等发达国家也相继将nat应用于血液筛查和临床样本的检测。借助核酸扩增技术，nat检测有特异性强、敏感性高等优点，极大的缩短了检测“窗口期”约10～14天。但nat的检测适用于hcv活跃感染期，免疫应答瞬时、局部控制的病毒复制暂时不能检出，大约15％-20％的hcv抗体阳性的患者因不能检出病毒而被诊断为已康复。另外，病毒rna在样品中十分不稳定，这就意味着血液样本必须立即检测或快速冷冻并贮存于-20℃或-80℃。

5、hcv核心抗原core作为丙型肝炎早期感染诊断指标，其相关研究近年来得到特别关注和快速发展。hcv core位于多聚蛋白前体的n端，由191个氨基酸组成，分子量大小在21kda左右。与其它结构蛋白和非结构蛋白相比，核心蛋白在不同hcv病毒株间氨基酸序列保守，加工成熟后无糖基化位点，抗原性强，是hcv感染检测的良好标志蛋白。另外，hcvcore血清转化时间要先于hcv抗体2-8周，与hcv rna血清转化时间基本一致，因此是hcv早期感染的重要诊断靶点。目前临床应用的hcv抗原检测方法主要采用elisa和电化学发光法等，这些检测方法操作均较为复杂，试剂成本较高，灵敏度提高的程度有限，制约了hcvcore检测的推广发展，因此研发灵敏特异的hcv core快速检测手段变得非常迫切。

6、胶体金免疫层析法是一种经济快速，应用场景广泛的检测方法。因其操作便捷、不需要特殊设备和场地，是目前最适合在基层医疗机构和家庭自测中推广使用的方法。但目前免疫结合胶体金层析法普遍存在一定缺陷，如对样本的敏感度低，质量控制能力不够，批间、批内和不同试剂间变异系数过大等。因此，提高抗单克隆抗体对的敏感度和特异性，是弥补免疫结合胶体金层析法缺陷的重要手段。

技术实现思路

1、为了解决上述本发明采用杂交瘤单克隆抗体制备技术，获取特异分泌hcv core抗原单克隆抗体的杂交瘤细胞株，并从中筛选到高特异、高灵敏的抗hcv core抗体对。基于筛选的hcv core单克隆抗体对，采用胶体金标记技术与免疫层技术相结合的方式，研发高灵敏hcv core抗原检测试纸条，从而达到早期诊断hcv感染的目的。该发明试纸基于双抗体夹心法，将特异性的hcv core单克隆抗体包被固定在nc膜上作为检测线t，羊抗鼠igg包被固定在nc膜上作为质控线c，胶体金标记的hcv core单克隆抗体作为检测试剂吸附在结合垫上，当待测样品加到试纸条一端的样品垫上后，通过毛细作用向前移动，溶解结合垫上的胶体金标记试剂后相互反应，形成抗原抗体-胶体金复合物，该复合物再移动至nc膜固定有捕获抗体的区域，复合物又与固定的抗体发生特异性结合而被截留，聚集在检测带上，形成肉眼可见的红色条带，从而判定是否是hcv core阳性。整个检测过程只需要5-10分钟，且结果判读方便准确。该hcv core抗原检测试纸能有效的检出hcv早期感染，且操作简单、成本低廉、结果判读方便准确，故适合在各级医疗机构推广应用，特别适合献血员初筛检测，床旁快速检测以及家庭自测使用。

2、有鉴于此，本发明的目的之一在于提供一种检测hcv core抗原的杂交瘤细胞df2；本发明的目的之二在于提供所述杂交瘤细胞df2分泌的单克隆抗体df2；本发明的目的之三在于提供所述单克隆抗体df2在制备检测hcv core抗原的检测试纸中的应用；本发明的目的之四在于提供含有所述单克隆抗体df2的检测试纸。

3、为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：

4、1、检测hcv core抗原的杂交瘤细胞df2，所述杂交瘤细胞df2保藏编号为gdmccno：63836，保藏日期为2023年09月26日，保藏单位为广东省微生物菌种保藏中心。

5、2、所述杂交瘤细胞df2分泌的单克隆抗体df2。

6、3、所述单克隆抗体df2在制备检测hcv core抗原的检测试剂中的应用。

7、本发明优选的，所述检测试剂的检测原理为胶体金法、免疫荧光层析法、酶联免疫法或化学发光法。

8、4、含有所述单克隆抗体df2的检测试剂。

9、本发明优选的，所述检测试剂的检测原理为胶体金法。

10、本发明优选的，所述检测试剂含有胶体金试纸条，所述胶体金试纸条包括样品垫、胶体金垫、包被了检测t线和质控c线的硝酸纤维素膜，吸收垫互相衔接粘贴在衬底板；所述检测t线包被抗体df2，所述胶体金垫上结合抗体ge1，所述抗体ge1由杂交瘤细胞ge1分泌。

11、本发明优选的，所述检测试剂含有胶体金试纸条，所述胶体金试纸条包括样品垫、胶体金垫、包被了检测t线和质控c线的硝酸纤维素膜，吸收垫互相衔接粘贴在衬底板；所述检测t线包被抗体df2，所述胶体金垫上标记抗体ge1，所述抗体ge1由杂交瘤细胞ge1分泌。

12、优选的，所述质控c线上包被l.5mg/ml羊抗鼠igg；所述t线上的单抗包被浓度为1.0mg/ml；所述胶体金标记的抗体按1ml胶体金结合50μg的抗体。

13、优选的，所述胶体金垫上的胶体金颗粒采用柠檬酸三钠还原法制备。

14、优选的，所述质控c线包被羊抗鼠igg本发明优选的，所述胶体金垫上的胶体金颗粒采用柠檬酸三钠还原法制备。

15、本发明优选的，所述质控c线包被羊抗鼠igg。

16、本发明的有益效果在于：本发明公开了检测hcv core抗原的杂交瘤细胞df2，还公开了由该杂交瘤细胞df2分泌的单克隆抗体，分泌的抗体能够与保藏编号为gdmcc no：63837的杂交瘤细胞株分泌的ge1抗体配对，用于检测hcv core抗原具有特异性好和灵敏度高的优点，因此可以制备检测hcv core抗原的试剂，也可以与配对抗体开发检测hcv core抗原的试剂条，为hcv core抗原的检测提供了新的工具。

17、本发明受重庆市自然科学基金项目资助，项目名称：基于量子点标记技术对丙型肝炎早期感染高灵敏快速检测研究，项目编号：cstc2021jcyj-msxmx0198。

18、生物材料保藏

19、本发明的babl/c小鼠杂交瘤细胞hcv core抗原单克隆抗体杂交瘤细胞株df2保藏于广东省微生物菌种保藏中心，地址位于广州市先烈中路100号大院59号楼5楼广东省科学院微生物研究所，其保藏编号为gdmcc no：63836，保藏日期为2023年09月26日，分类命名为babl/c小鼠杂交瘤细胞。

20、本发明的babl/c小鼠杂交瘤细胞hcv core抗原单克隆抗体杂交瘤细胞株ge1保藏于广东省微生物菌种保藏中心，地址位于广州市先烈中路100号大院59号楼5楼广东省科学院微生物研究所，其保藏编号为gdmcc no：63837，保藏日期为2023年09月26日，分类命名为babl/c小鼠杂交瘤细胞。