一种花鲈肝脏细胞系的建立方法

本发明属于肝脏细胞系建立，尤其涉及一种花鲈肝脏细胞系的建立方法。

背景技术：

1、花鲈(lateolabrax maculatus)，又名海鲈、七星鲈，隶属鲈形目、真鲈科、花鲈属，是一种凶猛的肉食性鱼类。花鲈肉鲜味美、营养丰富，并且具有适应性广、生长快速、抗病性强等优质特性，是我国重要的海水养殖经济鱼类之一。

2、近年来，随着花鲈养殖规模持续扩大和集约化高密度养殖的发展，花鲈养殖过程中易发生肝脏问题，如：脂肪肝等，制约花鲈养殖产业的健康持续发展。鱼类肝脏在能量代谢和营养调节中发挥着关键作用。通过研究鱼类肝脏，可以了解鱼类的能量储备和能量消耗机制，以及饲料营养成分对鱼类生长和养殖的影响。这对于鱼类养殖行业的可持续发展和鱼类的精准营养具有重要意义。鱼类细胞系是水产养殖包括鱼类生长、营养、疾病和遗传学等许多关键问题的重要工具。目前，尚未有花鲈肝脏细胞系的相关报道，有必要建立规范的花鲈肝脏细胞系分离和培养方法，为花鲈的体外研究精准营养提供可靠的研究材料。

技术实现思路

1、有鉴于此，本发明的目的在于提供一种方法简单易操作、构建方法重复性强，构建的细胞系稳定性好，能够稳定传代超过120代的花鲈肝脏细胞系的建立方法，采用本发明方法构建的花鲈肝脏细胞系细胞分裂旺盛，传代时间短。

2、为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：

3、本发明提供了一种花鲈肝脏细胞系的建立方法，包括以下步骤：

4、(1)肝脏组织的获取：将花鲈麻醉后，取血，直至无血液流出为止，然后取出肝脏组织；

5、(2)原代培养：将所述肝脏组织剪成1mm3的组织小块，将其接种至含有原代培养液的培养瓶中，倒置培养4-5h，补充原代培养液，进行原代培养，每天完全更换一次原代培养液，有细胞从组织块迁出后，每2天，半量更换一次原代培养液，连续培养长成细胞单层，得到肝脏原代细胞；

6、(3)传代培养：当肝脏原代细胞贴壁覆盖率达到80％-90％时，开始进行传代培养；先吸出原代培养液，用含抗生素的pbs缓冲液润洗2-3次，然后以含胰蛋白酶的消化液消化细胞直至悬起细胞变圆后，加入传代培养液中和胰蛋白酶反应，混匀，将细胞悬液接种于含有传代培养液的培养瓶中培养；1-10代以1:1进行传代，10代以后以1:2进行传代；每隔2-4天传代一次，每2天完全更换一次传代培养液；传至40代时，所述花鲈肝脏细胞系建立成功。

7、优选的，所述取血为尾静脉取血。

8、优选的，所述原代培养液是含有20％胎牛血清，5μg/ml人fgf，10μg/ml人egf，4％三抗的dmem/f-12基础培养基，所述三抗由400u/ml青霉素、0.4mg/ml链霉素及200μg/ml庆大霉素组成。

9、优选的，有细胞从组织块迁出的时间为3-4天，长成细胞单层的时间为10-15天。

10、优选的，所述传代培养液是含有15％胎牛血清，5μg/ml人fgf，10μg/ml人egf，1％三抗的dmem/f-12基础培养基，所述三抗由100u/ml青霉素、0.1mg/ml链霉素及50μg/ml庆大霉素组成。

11、优选的，原代培养和传代培养的温度均为28℃。

12、优选的，所述原代培养液和传代培养液的ph值均为7.0-7.4。

13、优选的，所述含抗生素的pbs缓冲液为包括1％三抗的pbs缓冲液，所述1％三抗由100u/ml青霉素、0.1mg/ml链霉素及50μg/ml庆大霉素组成。

14、优选的，还包括如下细胞冻存与复苏的步骤：

15、(1)细胞冻存：取对数生长期细胞，经所述含胰蛋白酶的消化液消化后，弃上清液；向细胞沉淀中加入细胞冻存液，重悬，使细胞数目为1×106个/ml，-80℃放置24h，然后置于液氮中长期保存；

16、(2)细胞复苏：从液氮中取出冻存物，置于28℃水浴锅中快速摇晃至融化；将解冻的细胞移至离心管中，加入所述传代培养液进行稀释，弃上清；用所述传代培养液重悬细胞，并接种于培养瓶中，28℃条件下培养，2-3天细胞即长成细胞单层。

17、优选的，所述细胞冻存液为dmem/f-12培养基、胎牛血清和dmso按7:2:1的体积比混合均匀所得，现配现用。

18、本发明的有益效果：

19、本发明提供的花鲈肝脏细胞系的建立方法，重复性强，简单易操作，构建的细胞系稳定性好，目前已经稳定传代超过120代。采用本发明方法构建的花鲈肝脏细胞系细胞性状优良，主要表现为多边形，上皮样形态，细胞分裂旺盛，传代时间短，能够用于病理学、生理学和分子遗传学等领域的研究和应用，比如可用于体外研究鱼类精准营养调控的分子机制，筛选饲料功能性添加剂以及探究营养代谢病理学等方面。

技术特征：

1.一种花鲈肝脏细胞系的建立方法，其特征在于，包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的建立方法，其特征在于，所述取血为尾静脉取血。

3.根据权利要求1所述的建立方法，其特征在于，所述原代培养液是含有20％胎牛血清，5μg/ml人fgf，10μg/ml人egf，4％三抗的dmem/f-12基础培养基，所述三抗由400u/ml青霉素、0.4mg/ml链霉素及200μg/ml庆大霉素组成。

4.根据权利要求1所述的建立方法，其特征在于，有细胞从组织块迁出的时间为3-4天，长成细胞单层的时间为10-15天。

5.根据权利要求1所述的建立方法，其特征在于，所述传代培养液是含有15％胎牛血清，5μg/ml人fgf，10μg/ml人egf，1％三抗的dmem/f-12基础培养基，所述三抗由100u/ml青霉素、0.1mg/ml链霉素及50μg/ml庆大霉素组成。

6.根据权利要求1所述的建立方法，其特征在于，原代培养和传代培养的温度均为28℃。

7.根据权利要求1所述的建立方法，其特征在于，所述原代培养液和传代培养液的ph值均为7.0-7.4。

8.根据权利要求1所述的建立方法，其特征在于，所述含抗生素的pbs缓冲液为包括1％三抗的pbs缓冲液，所述1％三抗由100u/ml青霉素、0.1mg/ml链霉素及50μg/ml庆大霉素组成。

9.根据权利要求1-8任意一项所述的建立方法，其特征在于，还包括如下细胞冻存与复苏的步骤：

10.根据权利要求9所述的建立方法，其特征在于，所述细胞冻存液为dmem/f-12培养基、胎牛血清和dmso按7:2:1的体积比混合均匀所得，现配现用。

技术总结
本发明提供了一种花鲈肝脏细胞系的建立方法，属于肝脏细胞系建立技术领域。本发明提供的花鲈肝脏细胞系的建立方法，重复性强，简单易操作，构建的细胞系稳定性好，目前已经稳定传代超过120代。采用本发明方法构建的花鲈肝脏细胞系细胞性状优良，主要表现为多边形，上皮样形态，细胞分裂旺盛，传代时间短，能够用于病理学、生理学和分子遗传学等领域的研究和应用。

技术研发人员：张春晓,李学山,王玲,宋凯,鲁康乐,林基彬,郑晓利
受保护的技术使用者：集美大学
技术研发日：
技术公布日：2024/3/11