本发明属于生物，涉及一种单细胞油脂生产工艺。
背景技术：
1、微生物油脂也称单细胞油脂，是微生物以碳水化合物、碳氢化合物和普通油脂为碳源，结合无机盐生产出的一些含有特殊脂肪酸或对人体有益的营养物质的功能性油脂。微生物油脂在食用油方面主要是能生产出一些功能性多不饱和脂肪酸，主要包括亚油酸、γ–亚麻酸、花生四烯酸、二十碳五烯酸(epa)、二十二碳六烯酸(dha)和二十二碳五烯酸(dpa)等。这些特殊脂肪酸大多是生物活性物质的前体，具有抗衰老、抗氧化、抗炎症、抑制肿瘤细胞形成、扩散和转移、防治心脏病、高血压等作用，其中epa、dha、dpa能促进婴儿神经系统发育，提高儿童智力。
2、单细胞油脂是指来自于可食用微生物(如真菌(例如酵母))和海藻的油脂。据估算，1t精炼酵母油的生产成本为800～1000美元，与动植物油相比没有经济效益优势。因此，单细胞油脂商业化开发转向了动植物油脂中含量极低且人和动物必需的花生四烯酸(ara)和二十二碳六烯酸(dha)的生产领域中。海洋微生物具有从头合成dha和大量积累这种脂肪酸的能力，并经食物链转移到鱼油中，但是海洋环境中的有毒有害污染物(如农药残留物、重金属等)可能进入海洋生物体内积累，成为鱼油安全食用的潜在威胁。
3、微生物油脂产品具有良好的安全性。大量的人体和临床试验表明，微生物油脂是人类可食用的安全食用油脂。由于微生物油脂全程在封闭、清洁的环境中生产，可以实现食品安全高度可控、可追溯。另外，由于是一个连续的生产过程，产品加工周期非常紧凑，微生物油脂中的dha、ara等敏感成分被采取了有效的保护措施，茴香胺值、反式脂肪酸、无良污染物得到良好的控制，因此产品具有很好的新鲜度、感官和货架期。
4、微生物油脂生产是一种可持续的发展方式。首先，微生物细胞具有生长周期短、繁殖速度快、易于培养，在节约劳动力的同时不受场地、气候、季节的限制，有利于连续化生产；其次，用于工业化的产油脂微生物合成的脂肪和功能性长链多不饱和脂肪酸(lcpufa)比动植物来源的含量高很多，例如裂壶藻干物质的含油率可高达60％，其中dha在油脂中含量高达60％；另外，微生物油脂生产一般综合利用玉米糖浆、大豆饼粕、酵母粉等大宗、低附加值农产品加工副产品作为原料，原料易得且资源集约、不消耗自然生态资源。这也是很多国家将微生物油脂作为解决供应链短缺支撑项目的重要原因之一。
5、经过了近80年的研究与发展，微生物油脂逐渐被市场所接受，并且随着社会环境与资源问题的日渐凸显，人们逐渐认识到发展微生物油脂的可行性与必要性。但遗憾的是微生物油脂较高的生产成本问题仍未得到有效的解决。
技术实现思路
1、本发明所要解决的技术问题是提高单细胞油脂产品的油脂含量。为此，发明提供一种单细胞油脂生产工艺。具体地，本发明通过在产油脂微生物发酵的不同阶段调控碳氮比来促进菌体的快速繁殖和积累油脂，并添加诱导剂对产油脂微生物的油脂分泌代谢网络进行人工干预，从而使其产生单细胞油脂。
2、本发明提供一种单细胞油脂生产工艺，包括如下步骤：
3、将产油脂微生物进行发酵培养，发酵20-26h时开始补料碳源和氮源，控制碳氮比为76-100:1，其中碳源的流速为每分钟流加初始发酵体积的0.02-0.03％，并根据碳氮比调节氮源流速；
4、发酵34-38h时，添加乙酰coa羧化酶和甘油三酯作为诱导剂诱导油脂的合成，使得乙酰coa羧化酶和甘油三酯的终浓度分别为0.02-0.05g/l和0.04-0.08g/l，碳氮比调整为200-232:1，其中碳源的流速为每分钟流加初始发酵体积的0.02-0.03％，并根据碳氮比调节氮源流速；
5、发酵至少45h，结束发酵，将发酵液离心，得到沉淀；将所述沉淀进行干燥，得到单细胞油脂产品。
6、在一些实施方案中，上述方法中，所述发酵培养使用的发酵培养基组成为：玉米浆干粉12-38g/l、甘油26-42g/l、酵母粉36-52g/l、硫酸镁1.8-16g/l、维生素b1 5.6-24g/l、甜菜碱6.5-18g/l、硫酸铵22-65g/l、磷酸二氢钾30-90g/l、磷酸氢二钠10-65g/l、硼酸5-7.5ml/l、mnso4·7h2o 200-400mg/l，ph为6-8。
7、在一些实施方案中，上述任一所述的方法中，所述发酵培养的初始od600为3-4，例如3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4.0，或这些数值中的任意二者之间的数值和范围，例如od600为3.6-3.8。
8、在一些实施方案中，上述任一所述的方法中，所述发酵培养中溶氧为20％以上，例如初始转速为200rpm，初始通气量为0.2vvm，并随着溶氧的下降逐渐提高转速和通气量，保证溶氧为20％以上。
9、在一些实施方案中，上述任一所述的方法中，所述补料的碳源为甘油。
10、在一些实施方案中，上述任一所述的方法中，所述补料的氮源为200-300g/l的硫酸铵水溶液，例如200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300g/l的硫酸铵水溶液，或这些数值中的任意二者之间的数值和范围，例如250g/l的硫酸铵水溶液。
11、在一些实施方案中，上述任一所述的方法中，所述发酵培养过程中，添加所述诱导剂之前控制发酵温度为32-35℃，添加所述诱导剂之后控制发酵温度为26-30℃。
12、在一些实施方案中，上述任一所述的方法中，所述干燥为喷雾干燥，例如用水重悬沉淀控制菌体湿重为480-660g/l，然后以进料速度1.2-2.4l/小时，进风温度110-125℃，频率为160-900赫兹进行喷雾干燥，即得到单细胞油脂产品。
13、在一些实施方案中，上述任一所述的方法中，在所述发酵培养之前还有种子培养的步骤，所述种子培养使用的种子培养基组成为：豆粕粉20-50g/l、甘油8-22g/l、酵母粉8-31g/l、酪蛋白胨40-62g/l、无氨基酵母氮源0.8-4g/l、碘化钾0.013-0.03g/l、肌醇0.12 -0.18g/l、核黄素0.22-0.38g/l、吡哆醇0.11 -0.26g/l、硫酸亚铁0.12-0.31g/l、生物素20-60mg/l、泛酸钙400-700mg/l，ph为5-7；
14、所述种子培养的条件可以为：温度33℃，转速150rpm。
15、在一些实施方案中，上述任一所述的方法中，所述产油脂微生物选自由解脂耶氏酵母(yarrowia lipolytica)、酿酒酵母(saccharomyces cerevisiae)、热带假丝酵母(candida tropicalis)组成的组。
16、在一些实施方案中，上述任一所述的方法中，所述单细胞油脂为dha、dpa、epa、亚油酸、γ–亚麻酸和花生四烯酸中的一种或多种。
17、本发明的原理如下：产油脂微生物的油脂积累过程能够受到环境因素的刺激调控；当环境中存在充足的碳源和氮源时，产油脂微生物处于增殖期，这一时期微生物快速增殖，自身合成的油脂类物质主要用于细胞骨架的形成，从而保持较高的菌体密度；而当环境中氮源含量降低，但碳源依然充足时，微生物转而进入油脂积累期，自身增殖速度快速减弱，并激活相应代谢途径的表达，从而将多余的碳源代谢转化为油脂储存在菌体细胞内，在此过程中甘油三酯协助乙酰coa羧化酶进入到细胞内后，乙酰coa羧化酶催化底物发生羧化反应，然后经多次链延长以及去饱和作用等形成相应的脂肪酸，随后经甘油三酯合成途径将合成的脂肪酸储存在体内。
18、本发明将产油脂微生物在特定的培养基上逐级培养；在菌体繁殖前期维持一定碳氮比，以利于菌体快速生长；当菌体生长中后期时，调整碳氮比及添加诱导剂，对微生物的油脂分泌代谢网络进行干预，激活相应代谢途径的表达，从而将多余的碳源代谢转化为油脂储存在菌体细胞内；发酵结束后，经过干燥得到单细胞油脂产品。
19、本发明得到的单细胞油脂产品中油脂的含量高，dha、dpa、epa、亚油酸、γ–亚麻酸和花生四烯酸的含量达到90％以上。另外，本发明的生产工艺稳定、简单、成本低。