基于笼状蛋白构建的纳米酶-工业酶偶联体系及其应用

本发明涉及绿色生物合成用催化体系，具体地，涉及一种基于笼状蛋白构建的纳米酶-工业酶偶联体系及其在催化合成α-酮酸方面的应用。

背景技术：

1、α-酮酸具有与氨基酸相同的碳骨架结构，是羰基位于与羧基相邻的α位点的一类有机化合物，在氨基酸的新陈代谢和维持氧化还原状态的过程中发挥关键作用。由于具有立体异构性，α-酮酸在有机化学合成中具有广泛应用，是生物燃料正丁醇、吲哚-3-乙酸、l/d型氨基酸生产的重要前体，被广泛应用于食品、医药、化工和化妆品等领域。例如，2-酮基-l-葡萄糖酸被广泛用作维生素c合成的前体；苯丙酮酸是抗菌化合物的重要原料；丙酮酸用于合成功能性饮料添加剂；2-酮基-d-葡萄糖酸通常用于合成抗氧化剂异抗坏血酸等。

2、目前，α-酮酸的合成方法主要包括化学合成法、微生物发酵法和酶转化法。化学合成法指利用某些化学物质在高温高压等极端条件下通过多步化学合成反应生成目标产物，但此法生产成本高、反应条件严苛，不仅步骤繁琐不易实现大规模工业化，而且会造成环境污染，不符合当下“绿色合成”的发展理念。因此，将化学化工的优势和生物科技相结合、以生物催化为核心内容的绿色生物制造是目前工业生产的主流技术，具有广泛的发展前景。其中，微生物发酵法即直接使用工程菌株发酵糖质原料或其他碳源生成α-酮酸，具有价格低廉、步骤简便的优点。然而，α-酮酸或其他副产物的积累会导致细胞生长速率减慢、底物转化率低。例如α-酮亮氨酸的碳酸转化率仅仅达到0.17 g α-酮亮氨酸/g葡萄糖，难以满足工业化的要求。酶转化法是近年来新发展的一种绿色生物制造技术，是利用指直接利用微生物体内天然存在的酶将底物氨基酸转化为α-酮酸，相较于其他方法具有高选择性、高效、无污染等优势。在不同的酶催化路径和合成方法中，以氨基酸氧化酶（aaos）为生物催化剂的反应因其高性能和温和的反应条件而受到广泛关注。然而，反应产物h2o2的积累不可避免地会使aao失活并引起副产物增加，导致催化效率下降、α-酮酸产率低。

3、为了克服生物制造中h2o2的负面影响，基于aao的催化反应通常在过氧化氢酶（cat）存在下进行。冯嵬等人将融合弹性蛋白样多肽（elp）修饰的d 氨基酸氧化酶（daao）和cat同时固定在多壁碳纳米管上，催化氨基酸氧化脱氨的同时实现h2o2分解，显著减少酶的降解和副产物对催化的抑制作用。随后，该课题组进一步研究了精确控制两种酶摩尔比的合成方法，即利用内含肽介导的蛋白质剪接将daao亚基的n端和cat亚基的c端通过天然肽进行特异性连接，拼接产物表现出更高的稳定性和酶催化效率。尽管多酶系统有利于h2o2的高效分解和α-酮酸合成，但天然酶的成本高、稳定性有限、重复使用性差、分离纯化耗时等固有缺点极大地限制了其在大规模生产中的广泛应用。克服多酶系统问题的一种有前景的方法是结合化学催化和生物催化来设计新的反应路线。

4、纳米酶作为一种具有类似天然酶催化活性的纳米材料，已经被广泛应用于天然酶的替代应用研究。使用具有类cat活性的纳米酶用于分解α-酮酸合成过程中产生的h2o2是一个有效策略。冯嵬课题组采用锆基配位聚合物（zr-cp）衍生的空壳微球（hmno2@zr-cp）作为载体固定组氨酸标记的daao，由此形成的共轭物能够有效催化丙酮酸的合成，然而，其催化h2o2分解的能力有限。石家福等人利用pt纳米粒子（ptnps）作为类cat纳米酶催化h2o2分解，在l-氨基酸氧化酶（laao）催化的l色氨酸氧化中用于α-酮酸合成。然而，由于ptnps对laao二级结构的负面影响，必须使用两种催化剂的区室化来避免它们的不相容性。事实证明，化学催化和酶催化之间的内在不相容性是它们组合用于化学酶促合成的一个巨大挑战。为了应对这一挑战，一种方法是通过体外分隔通道策略分别固定化学催化剂和酶。然而，该策略需要多步程序，因此往往耗时且对酶不友好。不同催化剂的分隔也会对反应中间体产生传质阻力。因此，非常值得开发一种与天然酶相容的类cat纳米酶用于工业生产。

技术实现思路

1、针对上述α-酮酸的合成过程中通过体外分隔通道分别固定类cat纳米酶和化学催化剂，存在工艺复杂、对酶不友好，且对反应中间体产生传质阻力的问题，本发明提供了一种基于笼状蛋白构建的纳米酶-工业酶偶联体系及其应用，该偶联体系是基于生物蛋白质仿生合成和生物矿化的方法构建的，能够催化底物氨基酸氧化脱氨。同时，体系中的纳米酶具有类cat活性，能够清除上述催化反应过程中的副产物h2o2，从而避免了后者引起的工业酶失活和产率下降。纳米酶的负载能够显著提高氨基酸氧化酶的活性、对底物氨基酸的亲和力，有效降低酶对h2o2的敏感性，从而显著提升了该体系的稳定性和α-酮酸产率。

2、为了实现上述目的，本发明一方面提供一种基于笼状蛋白构建的纳米酶-工业酶偶联体系，该偶联体系包括：

3、笼状蛋白壳；

4、氨基酸氧化酶或氨基酸氧化还原酶，封装于所述笼状蛋白壳内；和

5、金属纳米酶，具有类过氧化氢酶催化活性，且封装于所述笼状蛋白壳内。

6、本发明使用的氨基酸氧化酶是工业生产α-酮酸及合成手性胺前体物质的常用工业催化剂。氨基酸氧化酶能够催化氨基酸脱氢生成亚氨基酸，再进一步自发水解生成酮酸和氨，脱下的氢由黄素蛋白传递给氧，生成h2o2。此类酶多以分子氧为电子受体，所以命名为氧化酶。因此，本发明中的氨基酸氧化酶还可以是其他同种类型的氧化还原酶，如多酚氧化酶、单胺氧化酶、甲酸脱氢酶（fdh）等。

7、所述蛋白壳可以是基因重组的或是天然的封装蛋白（encapsulin），是由具有hk97噬菌体样折叠的单一类型的壳原体组成的自组装二十面体蛋白质隔室，可以组装成 t1（60个亚基，约24 nm）、t3（180个亚基，约32 nm）和 t4（240个亚基，约42 nm）结构，可以来源于海栖热袍菌、拓展短杆菌、激烈热球菌等。

8、作为本发明的一种优选方案，本发明所述的蛋白壳采用来源于海栖热袍菌的封装蛋白（encapsulin）。这种蛋白质具有较高的机械抵抗力和温度稳定性，能够为内部的货物蛋白提供保护和一些非特异性水解酶，其n端具有特殊的结构域，研究表明当货物蛋白c端带有一段特定的保守序列时，货物蛋白能够在自组装过程中结合到encapsulin的n端结构域并被包封在其蛋白笼内部。

9、优选地，本发明所述氨基酸氧化酶是融合了表达靶向肽和6 × his标签的氨基酸氧化酶。

10、具体地，所述金属纳米酶选自铑（rh）、钯（pd）、铂（pt）、钌（ru）和锇（os）中的一种，可以用简单的生物矿化方法合成及装载。

11、作为本发明所述的偶联体系的一个优选实施例，偶联体系包括：

12、笼状蛋白壳，来源于海栖热袍菌，具有如seq id no.2所示的氨基酸序列；

13、氨基酸氧化酶，融合表达靶向肽和6 × his标签，具有如seq id no.1所示的氨基酸序列，和

14、金属纳米酶pd；

15、所述氨基酸氧化酶和所述金属纳米酶pd封装于所述笼状蛋白壳内。

16、所述笼状蛋白壳中的蛋白与金属纳米酶pd的摩尔比为1：（300-1000）。

17、seq id no.1如下：

18、met his his his his his his gly gly gly gly ser his ser gln lys argval val val leu gly ser gly val ile gly leu ser ser ala leu ile leu ala arglys gly tyr ser val his ile leu ala arg asp leu pro glu asp val ser ser glnthr phe ala ser pro trp ala gly ala asn trp thr pro phe met thr leu thr aspgly pro arg gln ala lys trp glu glu ser thr phe lys lys trp val glu leu valpro thr gly his ala met trp leu lys gly thr arg arg phe ala gln asn glu aspgly leu leu gly his trp tyr lys asp ile thr pro asn tyr arg pro leu pro serser glu cys pro pro gly ala ile gly val thr tyr asp thr leu ser val his alapro lys tyr cys gln tyr leu ala arg glu leu gln lys leu gly ala thr phe gluarg arg thr val thr ser leu glu gln ala phe asp gly ala asp leu val val asnala thr gly leu gly ala lys ser ile ala gly ile asp asp gln ala ala glu proile arg gly gln thr val leu val lys ser pro cys lys arg cys thr met asp serser asp pro ala ser pro ala tyr ile ile pro arg pro gly gly glu val ile cysgly gly thr tyr gly val gly asp trp asp leu ser val asn pro glu thr val glnarg ile leu lys his cys leu arg leu asp pro thr ile ser ser asp gly thr ileglu gly ile glu val leu arg his asn val gly leu arg pro ala arg arg gly glypro arg val glu ala glu arg ile val leu pro leu asp arg thr lys ser pro leuser leu gly arg gly ser ala arg ala ala lys glu lys glu val thr leu val hisala tyr gly phe ser ser ala gly tyr gln gln ser trp gly ala ala glu asp valala gln leu val asp glu ala phe gln arg tyr his gly ala ala arg glu ser lysleu gly gly gly gly ser gly gly gly ser asn thr gly gly asp leu gly ile arglys leu；

19、seq id no.2如下：

20、met glu phe leu lys arg ser phe ala pro leu thr glu lys gln trp glnglu ile asp asn arg ala arg glu ile phe lys thr gln leu tyr gly arg lys pheval asp val glu gly pro tyr gly trp glu tyr ala ala his pro leu gly glu valglu val leu ser asp glu asn glu val val lys trp gly leu arg lys ser leu proleu ile glu leu arg ala thr phe thr leu asp leu trp glu leu asp asn leu gluarg gly lys pro asn val asp leu ser ser leu glu glu thr val arg lys val alaglu phe glu asp glu val ile phe arg gly cys glu lys ser gly val lys gly leuleu ser phe glu glu arg lys ile glu cys gly ser thr pro lys asp leu leu gluala ile val arg ala leu ser ile phe ser lys asp gly ile glu gly pro tyr thrleu val ile asn thr asp arg trp ile asn phe leu lys glu glu ala gly his tyrpro leu glu lys arg val glu glu cys leu arg gly gly lys ile ile thr thr proarg ile glu asp ala leu val val ser glu arg gly gly asp phe lys leu ile leugly gln asp leu ser ile gly tyr glu asp arg glu lys asp ala val arg leu pheile thr glu thr phe thr phe gln val val asn pro glu ala leu ile leu leu lysphe。

21、本发明第二方面提供一种上述的偶联体系中氨基酸氧化酶的核酸序列。

22、本发明第三方面提供一种包含上述核酸序列的重组表达载体。

23、本发明第四方面提供一种包含上述重组表达载体的重组表达转化体。

24、本发明第五方面提供一种基于笼状蛋白构建的纳米酶-工业酶偶联体系，该偶联体系包括笼状蛋白以及封装在所述笼状蛋白内的氨基酸氧化酶和具有类过氧化氢酶催化活性的金属纳米酶，所述氨基酸氧化酶如下任意一种：

25、（1）上述重组表达转化体细胞内的氨基酸氧化酶；

26、（2）上述重组表达转化体细胞破碎后得到的粗酶液或粗酶粉；

27、（3）上述重组表达转化体细胞经破碎、提纯后获得的纯酶。

28、本发明第六方面提供一种上述基于笼状蛋白构建的纳米酶-工业酶偶联体系在催化合成α-酮酸方面的应用。

29、通过上述技术方案，本发明实现了以下有益效果：

30、本发明利用笼状蛋白为基架，将氨基酸氧化酶或氨基酸氧化还原酶以及具有类过氧化氢酶（cat）催化活性的纳米酶包封在内，该偶联体系能够有效催化氨基酸氧化，α-酮酸产率提高8.57倍，同时具备h2o2分解能力，使h2o2对工业酶体系的半抑制浓度提高10倍，有望克服aaos等工业酶的应用瓶颈，实现α-酮酸的稳定绿色合成，并为化学催化和酶催化的结合提供范式，具有良好的应用前景。