通过电场力去除杂电解质的方法及应用与流程

【】本发明属于分析化学和生物，具体地提供一些通过电场力去除吸附杂电解质的分离方法。其应用包含但不限于：蛋白质、核酸(dna、rna等)、糖(单糖、寡糖和多糖等)分离和/富集；在pulldown实验、免疫沉淀实验(immunoprecipitation，ip)、免疫共沉淀实验(co-immunoprecipitation，co-ip)、染色质免疫沉淀法(chromatinimmunoprecipitation，chip)、rna结合蛋白免疫沉淀法(rna binding proteinimmunoprecipitation，rip)等实验中，也有广泛的应用。

背景技术

0、
背景技术：

1、随着基因组测序技术的发展，生物基因组的序列、结构和功能研究飞速发展，而获得高纯度、高含量和高完整度的生物基因组dna是基因组测序技术得以应用的首要前提。随着生物学的发展，基因的转录产物rna的研究也越来越受到研究者们的青睐。

2、越来越多的dna、rna以及两者共提的提取方法被开发出来。具体来说，传统的生物基因组dna提取方法主要有ctab和sds法；常见的生物rna提取方法主要有trizol法、硫氰酸胍/酚法、sds/酚法、盐酸胍法等。

3、传统的dna和/或rna提取方法存在缺点：操作复杂，费时，纯度低，不利于大批量分离和富集dna和/或rna等。近年出现各种商业化的微球和磁性纳米材料用于分离和/或富集dna和/或rna，可以克服传统分离和/或富集dna和/或rna方法的缺点。使dna和/或rna的提取有了很大的进步。但是，方法本身也存在缺点：用于分离和/或富集dna和/或rna的微球和磁性纳米材料也能够吸附蛋白质和/或糖类物质等，尤其是纳米材料比表面积大，吸附能力强，更容易吸附杂质。

4、近年来，随着人类基因组计划的完成，解析庞大的人类基因组信息的工作也被提到日程上。蛋白质作为基因转录和翻译的产物，也拥有巨大的生物学信息，开展蛋白质组学的研究，获取蛋白质表达水平的信息备受研究者的青睐与重视。作为蛋白质组学研究的前提和基础，蛋白质的分离纯化具有非常重要的生物学意义。目前，研究者利用蛋白质分子自身的性质差异开发出一系列的蛋白质分离和/或富集的方法：蛋白质分子大小不同建立了超滤、凝胶过滤、胶体电泳等方法；蛋白质分子所带电荷不同发展了离子交换层析、凝胶电泳、等电点沉淀等方法；蛋白质分子亲疏水性不同发展了亲和层析方法等。

5、但是这些方法在用于蛋白质分离和/或富集的时候，也有一定的不足之处，例如凝胶过滤法所用的凝胶一般需要预先制备和处理，费时且操作复杂；离子交换层析法的离子交换柱的装填和预处理也比较繁琐；亲和层析法对蛋白质的分离任然存在非专一性的吸附等。

6、在pulldowr实验、ip实验、co-ip实验、chip实验、rip等实验中都需要制备纯的微球(beads)或纳米材料与抗体或蛋白质分子探针复合物，以及分子探针结合到目标物后，也可以通过本发明提供的方法去除非特异性吸附蛋白而保留特异性结合的目标蛋白。但是，由于微球或纳米材料表面的化学基团或非常大的比表面积存在非专一性的吸附而让实验止步不前。

7、本发明所要解决的技术问题是消除微球或纳米材料表面非专一性吸附的问题，基于带电荷离子在电场内受电场力作用的原理，提供一些价廉、快速、简便的消除非专一性吸附的杂电解质的方法及其应用。

技术实现思路

0、
技术实现要素：

1、本发明的目的在于克服上述现有技术中存在的不足，提供一些通过电场力去除非专一性吸附杂电解质的方法以及其应用：在蛋白质、核酸(dna、rna等)、糖(单糖、寡糖和多糖等)分离和/富集方面有着广泛的应用；在pulldown实验、ip实验、co-ip实验、chip实验、rip等实验中，也有广泛的应用等。

2、1.如权利要求1所述，在电场力的作用下，快速去除杂电解质而保留目标物的分离和/或富集方法和/或制备含有目标物和基质的方法，其特征在于包括以下步骤：

3、a)把基质放入含有目标物的混合物溶液中孵育，使目标物结合到基质上；

4、b)在一次和/或一次以上电场力的作用下，去除杂电解质，保留基质和目标物；

5、c)和/或把目标物从基质上洗脱下来，达到分离或纯化目标物的目的；

6、d)和/或把结合目标物的基质作为整体用于下一步实验。

7、出于本发明的目的，术语“杂电解质”表示在水溶液中能够带解离出带电荷的离子而又不是分离和/或富集的目标物。

8、出于本发明的目的，术语“目标物”表示需要分离和/或富集的物质，如：核酸(dna和rna等)、蛋白质、糖类等。

9、出于本发明的目的，术语“核酸”表示包含但不限于：天然，优选分离的、线性、支化或环状核酸如rna，具体是mrna、sirna、mirna、snrna、trna、hnrna、microrna或核酶，dna，质粒dna，线粒体dna等。

10、出于本发明的目的，术语“基质”表示能够特异性结合目标物的固态物质，包含但不限于：各种商业化分离和/或富集dna、rna、蛋白质的微球、磁性微球、纳米材料等。

11、作为一种优选方案，在电场力除去杂电解质前，和/或用清洗液对目标物和基质清洗，除去一些能溶解于清洗液的非专一性吸附的杂电解质。

12、如权利要求2所述，基质包含但不限于：各种商业化的微球，如：各种分离和/或富集dna、rna和蛋白质的微球、各种商业化的磁性微球，如：各种分离和/或富集dna、rna和蛋白质的磁性微球、各种商业化的磁性纳米材料，如：各种分离和/或富集dna、rna和蛋白质的纳米材料等。由于微球或磁性纳米材料表面有一些化学基团修饰，在静电作用、疏水作用和/或范德华力等作用下，会发生非特性吸附的现象，尤其是纳米材料具有非常大的比表面积，非特异性吸附更加严重。

13、如权利要求3所述，，其特征在于：目标物含有的标签包含但不限于：糖蛋白或糖肽的糖链、磷酸化蛋白质或磷酸化肽的磷酸基团、泛素化蛋白的泛素基团、糖上的羟基、核酸包括dna、rna等上的羟基等、his标签重组蛋白(6个组氨酸残基组成的融合标签)、flag-tag重组蛋白(8个氨基酸的亲水性多肽(dykddddk)组成的融合标签)、avitag重组蛋白(15个氨基酸的短肽组成的融合标签)、snap-tag重组蛋白(是从人的o6-甲基鸟嘌呤-dna甲基转移(o6-alkylguanine-dna-alkyltransferase)获得)、gst重组蛋白(谷胱甘肽巯基转移酶)标签、c-myc标签重组蛋白(含有11个氨基酸的小标签)等。目标物通过标签结合到基质上，形成新的复合物。

14、如权利要求4所述，其特征在于：杂电解质包含但不限于：蛋白质、肽、核酸、无机盐等。

15、如权利要求5和6所述，对于杂电解质组分少而且简单的，进行1次电场力除杂即可。其中，当杂电解质为两性物质时，电泳液的ph值与杂电解质中的两性物质的等电点(pi)不能相等。但是，对于杂电解质组分多和/或包含两性物质，需要2次和/或2次以上的电场力除杂，电泳液1的ph值与电泳液2的ph值和/或其他电泳液的ph值都不能相等。当电泳液的ph值与两性物质的pi相等时，两性物质不带电荷，在电场中不受电场力的作用，从而不能起到杂电解质和目标物的分离；当有多种两性物质时，就会出现很多不同的pi，而且当电泳液的ph值与pi相近的时候，杂电解质受到的电场力也很小。如果杂电解质受到的电场力小于杂电解质在基质表面的吸附力的时候，也不能起到分离杂电解质和目标物的目的。所以，在保持目标物生物活性的前提下，2种电泳液的ph值差越大越好，对去除非专一性吸附更彻底。

16、根据优选的实施方式，电场力除去杂电解质的次数在一次或一次以上，对于组成简单的体系，一优选的电场力除去杂电解质次数为1次；对于组成复杂且含有多种两性物质的体系更优选的电场力除去杂电解质的次数为2次。

17、如权利要求7所述，当杂电解质与基质结合力很大的时候，和/或提高液体中表面活性剂或是有机物的浓度，降低杂电解质与基质的结合力，有利于去除杂电解质。另外，和/或提高液体中盐的浓度，降低杂质与基质的结合力，有利于去除杂电解质。

18、如权利要求8所述，产生电场力的电场为匀强电场或非匀强电场。

19、如权利要求9所述，传递电场力的介质为电泳液或真空或稀薄空气。

20、如权利要求10所述，在电场力的作用下，

21、-和/或结合目标物的基质(直径d1)保留在胶(直径d2)外，杂电解质(直径d3)进入胶内，其中，d1＞d2＞d3；

22、-和/或结合目标物的固体物质(直径d1)保留在含有很多小孔(孔径d4)口袋内，杂电解质(直径d3)移向两极，其中，d1＞d4＞d3；

23、-和/或结合目标物的基质吸附在磁铁或产生磁力的装置上，如电磁铁等，杂电解移向两极。从权利要求8、9、10所述的情况中各取其中一种情况或一种以上情况，组合起来都可以形成一种分离和/或富集的方法。如：静电场，传到电场力的介质为液体和含有目标物的固体物质(直径d1)保留在含有很多小孔(孔径d4)口袋内，杂电解质(直径d3)移向两极，其中，d1＞d4＞d3，可以组合成一种新的分离和/富集方法。

24、如权利要求11所述，其特征在于：电压：50v～30000v；电流：0ma和/或10ma～10a。进行大批量处理样品的时候，需要高压才能提供足够的电场力把杂电解质去除。在匀强电场下，通过真空或稀薄空气-电泳液-真空或稀薄空气传递电场力，使带电荷的杂电解质移向两极，而目标物和基质停留在带有微孔的小袋子内。其本质让杂电解质电荷重新分布到匀强电场两极，不形成电流，所以电流为0ma。

25、如权利要求12所述，其特征在于：和/或对基质和目标物清洗，进一步去除吸附在其上的杂电解质。由于基质和目标物可以非特异性的吸附一些杂电解质，为了方便后续处理，可以通过清洗液去除被吸附的杂电解质。

26、如权利要求13所述，其特征在于：当目标物为活性蛋白质的时候，其分离条件如下：

27、-液体中不能含有超过让生物大分子活性降低的变性剂的浓度，如：液体中不含有十二烷基磺酸钠(sds)，或使其含量极低；

28、-和/或液体中含有蛋白质抑制剂，如：苯甲基磺酰氟(phenylmethanesulfonylfluoride or phenylmethylsulfonyl fluorid，pmsf)、胃蛋白酶抑制剂(pepstantin)、亮抑蛋白酶肽(leupeptin)、胰蛋白酶抑制剂(aprotinin)、混合蛋白酶抑制剂、edta、乙二胺四乙酸二钠等；

29、-和/或液体中含有蛋白质保护剂，如：一元醇为甲醇或乙醇，二元醇为乙二醇、丙二醇、丁二醇，三元醇为丙三醇，二醇聚合物为聚乙二醇、聚丙二醇、乙二醇于丙二醇的共聚物，多羟基单糖为葡萄糖、果糖、甘露糖、木糖，二糖为蔗糖、乳糖、麦芽糖，多糖为淀粉、葡聚糖等。优选的是甘油；

30、-和/或温度控制在0℃-25℃，最优选的温度为4℃；

31、-和/或用琼脂糖凝胶或非变性page等吸收杂电解质。

32、如权利要求14所述，其特征在于：该分离方法可以应用在下面的实验中，包含但不限于：pulldown实验、免疫沉淀实验(immunoprecipitation，ip)、免疫共沉淀实验(co-immunoprecipitation，co-ip)、染色质免疫沉淀法(chromatin immunoprecipitation，chip)、rna结合蛋白免疫沉淀法(rna binding protein immunoprecipitation，rip)等。

33、在pulldown实验中，需要预先制备纯的微球或纳米材料与带有分子标签的蛋白质a形成的复合物而不能让杂蛋白吸附在复合物上。具体的来说，通过基因分子重组工程把连接微球或纳米与蛋白质a的标签添基因连接到表达系统基因组内(四大蛋白质表达系统：大肠杆菌表达系统、酵母表达系统、昆虫细胞表达系统和哺乳动物表达系统)，表达重组蛋白，非变性地裂解细胞或是收集表达在上清中的重组蛋白，把功能性的微球或纳米材料加入被裂解细胞的混合物或是含有重组蛋白的上清中，孵育，形成微球或纳米材料与蛋白质a的复合物。用本发明提供的去除杂电解质的方法去除杂蛋白，从而制备纯的微球或纳米材料与蛋白质a复合物。如果，杂蛋白没有去除干净，会让实验止步不前或能极大降低后续的分析工作和/或实验工作。然后，把该复合物加入待分析的蛋白质提取混合物中孵育，使与蛋白质a相互作用的蛋白质b、和/或蛋白质c、和/或蛋白质d......等结合形成新的复合物，再次用本发明提供的除杂方法，去除被吸附的杂蛋白质。这样会极大降低后续的分析和验证工作。

34、在ip实验中，抗体与细胞裂解液或表达上清中相应的蛋白结合后，再与蛋白a/g(proteina/g)或二抗偶联的微球或纳米材料孵育，通过离心得到微球或纳米材料-蛋白a/g或二抗-抗体-目的蛋白复合物，和/或沉淀经过洗涤后，用本发明提供的去除杂电解质的方法去除被吸附的杂蛋白。这样会极大降低后续的分析和验证工作。

35、在co-ip实验中，当细胞在非变性条件下被裂解时，完整细胞内存在的许多蛋白质-蛋白质间的相互作用被保留了下来。当用预先固化在功能性的微球或纳米材料上的蛋白质a的抗体免疫沉淀a蛋白，那么与a蛋白在体内结合的b蛋白也能一起沉淀下来。再通过蛋白变性分离，对b蛋白进行检测，进而证明两者间的相互作用。形成新的微球或纳米材料-蛋白质a抗体-蛋白质a-蛋白质b的复合物上也会吸附一些杂蛋白，用本发明提供的去除杂电解质的方法去除被吸附的杂蛋白。这样会极大降低后续的分析和验证工作。

36、在chip实验中，其基本原理是在活细胞状态下固定蛋白质-dna复合物，并将其随机切断为一定长度范围内的染色质小片段，然后通过免疫学方法沉淀此复合物，特异性地富集目的蛋白结合的dna片段，通过对目的片断的纯化与检测，从而获得蛋白质与dna相互作用的信息。形成新的微球或纳米材料-蛋白a/g或二抗-抗体-蛋白质-dna的复合物上也会吸附一些杂蛋白，用本发明提供的去除杂电解质的方法去除被吸附的杂蛋白。这样会极大降低后续的分析和验证工作。

37、在rip实验中，其基本原理是在细胞内蛋白质-rna复合物，然后通过免疫学方法沉淀此复合物，特异性地富集目的蛋白结合的rna片段，通过对目的片断的纯化与检测，从而获得蛋白质与rna相互作用的信息。形成新的微球或纳米材料-蛋白a/g或二抗-抗体-蛋白质-rna的复合物上也会吸附一些杂蛋白，用本发明提供的去除杂电解质的方法去除被吸附的杂蛋白。这样会极大降低后续的分析和验证工作。

38、如权利要求15所述，含有标签的目标物包含但不限于：糖蛋白或糖肽、磷酸化蛋白质或磷酸化肽、核酸(dna、rna等)、糖(单糖、寡糖和多糖等)、泛素或泛素化蛋白、有抗体的蛋白质、his标签重组蛋白(6个组氨酸残基组成的融合标签)、flag-tag重组蛋白(8个氨基酸的亲水性多肽(dykddddk)组成的融合标签)、avitag重组蛋白(15个氨基酸的短肽组成的融合标签)、snap-tag重组蛋白(是从人的o6-甲基鸟嘌呤-dna甲基转移(o6-alkylguanine-dna-alkyltransferase)获得)、gst重组蛋白(谷胱甘肽巯基转移酶)标签、c-myc标签重组蛋白(含有11个氨基酸的小标签)等。

39、例如，本发明在分离或纯化蛋白质中的糖蛋白质或糖肽中的应用。与本发明相关的糖肽或糖蛋白的分离和/富集方法包含但不限于：凝集素亲和层析法、酰肼法、硼酸法、二氧化钛(tio2)富集法、亲水作用液相色谱(hilic)等。

40、凝集素亲和层析法，通常将凝集素固定在琼脂糖、二氧化硅或多羟基聚合物等支持物上，凝集素会特异性的识别底物糖蛋白或糖肽上的糖链，并结合，经过层析柱去除吸附的非糖蛋白和/或非糖肽。

41、酰肼法，聚糖的顺式二羟基被高碘酸盐氧化，然后与固定有酰肼基团的树脂发生共价偶联。与凝集素亲和法相反，酰肼捕获是非特异性的，可以富集所有糖缀合物。

42、硼酸法，硼酸能够与含1-2和1-3顺式二羟基的糖类(例如甘露糖、葡萄糖和半乳糖)发生共价但可逆的化学反应，进而形成稳定的环酯。硼酸识别聚糖是非特异性的，即可以识别有各种分支的聚糖，也可以识别线性聚糖，还可以识别单糖，从而能够无偏嗜地富集各种n-和o-连接的糖肽。

43、能够分离和/或富集糖蛋白或糖肽的微球、磁性微球、纳米材料也可以用来分离和/或富集糖类。同样也可以用本发明提供的方法去除非特异性吸附的杂蛋白或核酸等。

44、二氧化钛(tio2)富集法，tio2因其对唾液酸的亲和力而被用于糖肽富集。由于磷酸肽和糖肽都与tio2结合，因此通过磷酸酶(neb提供lambda蛋白磷酸酶可用于蛋白去磷酸化)预处理去除磷酸修饰有利于提高糖肽的富集效率。

45、亲水作用液相色谱(hilic)法是一种很有前景的分离及富集方法，能分离糖蛋白及来源于糖蛋白的的糖肽和聚糖。hilic的特点是使用基于阳离子交换、阴离子交换、两性离子相互作用和琼脂糖凝胶的亲水固定相，和相对疏水的有机流动相。由于结构中具有亲水性的碳水化合物部分的影响，糖肽能够被更牢固地结合在hilic柱上，从而与糖蛋白水解消化产物中的非糖基化肽发生分离。糖肽中寡糖的亲水性使其成为hilic分离的绝佳对象。

46、如上所述的各种糖蛋白或糖肽分离和/或富集法有共同的特点：糖蛋白或糖肽能结合到功能化的基质上，也都存在非特异性的吸附。可以用本发明提供的方法除去非特异性吸附的杂蛋白。

47、更具体来说，与本发明相关的磷酸化蛋白或磷酸化肽的分离和/富集方法包含但不限于：固相金属离子亲和色谱法(immobilized metal affinity chromatograph，imac)和金属氧化物亲和色谱法(metal oxide affinity chromatography，moac)。

48、imac：利用过渡态金属阳离子，如fe3+、ga3+、zr4+等，作为亲和试剂，与阴离子结合。ti4+离子是该类试剂中新兴的应用。这些金属阳离子通过螯合作用，固定在具有磁性的磁珠或硅颗粒上，从而在去除非磷酸化肽段的过程中能够保留磷酸化的肽段。

49、moac：利用氧化金属可以和磷酸根基团中的氧结合的特性进行磷酸化肽段的富集。钛的氧化物(tio、ti2o3、tio2)是最常用的moac试剂，此外fe3o4也比较常见。

50、如上所述的2种磷酸化蛋白或磷酸化肽分离和/或富集法有共同的特点：磷酸化蛋白或磷酸化肽能结合到功能化的基质上，也都存在非特异性的吸附。可以用本发明提供的方法除去非特异性吸附的杂蛋白。

51、更具体来说，与本发明相关的核酸分离和/富集方法包含但不限于：功能化的微球、磁性微球和纳米材料能特异性识别和高效结合核酸(dna、rna等)，从而分离和/富集核酸。但是也会产生非特异性的吸附，尤其是吸附蛋白质。可以用本发明提供的方法除去非特异性吸附的蛋白质。

52、更具体来说，与本发明相关的存在抗体蛋白分离和/富集方法包含但不限于：功能化的微球、磁性微球和纳米材料结合抗体，然后，含有底物蛋白的蛋白质提取混合物孵育，形成新的功能化的微球或纳米材料-蛋白a/g或二抗-抗体-蛋白质复合物。可以用本发明提供的方法除去非特异性吸附的杂蛋白。其中，传统泛素化蛋白分离和/或富集方法也属于抗体和抗原特异性识别免疫反应的原理。

53、更具体来说，通过dna分子重组基因工程在目的蛋白的基因上引入特定的标签，用于分离和/或富集目标蛋白。引入的标签包含但不限于：his标签重组蛋白(6个组氨酸残基组成的融合标签、flag-tag重组蛋白(8个氨基酸的亲水性多肽(dykddddk)组成的融合标签)、avitag重组蛋白(15个氨基酸的短肽组成的融合标签)、snap-tag重组蛋白(是从人的o6-甲基鸟嘌呤-dna甲基转移(o6-alkylguanine-dna-alkyltransferase)获得)、gst重组蛋白(谷胱甘肽巯基转移酶)标签、c-myc标签重组蛋白(含有11个氨基酸的小标签)。在实际应用中，最常用的是his标签和gst标签。功能化的微球、磁性微球或纳米材料通过标签结合目标蛋白形成新的复合物。可以用本发明提供的方法除去非特异性吸附的杂蛋白。

54、如权利要求16所述，所用的电泳液成特征在于：

55、-至少含有h2o；

56、-和/或含有酸，包含但不限于：盐酸、冰醋酸、硫酸等，优选的是盐酸，主要是在调节电泳液的ph值时，需要用盐酸。

57、-和/或含有碱，包含但不限于：氢氧化钠、tris-base碱等，优选的是tris-base碱，为了稳定电泳液的ph值。

58、-和/或含有盐或盐类混合物，包含但不限于：氯化钠、醋酸钠、氯化钾等，优选的是氯化钠，提供极性环境有利于杂电解质的去除。

59、-和/或一种或一种以上能溶于水的有机物，优选包含但不限于：甘油、甘氨酸、咪唑等，更优选的是甘油。主要是分离和/制备活性蛋白质的时候，甘油可以起到保护蛋白质活性的作用。

60、-和/或一种或一种以上表面活性剂，即阳离子型表面活性剂、阴离子型表面活性剂、两性离子型表面活性剂和/或非离子型表面活性剂。以所述试剂的总体积计，其用量：重量/体积在0～50％之间，优选的是聚乙烯吡咯烷酮40(pvp40)、4-壬基苯基-聚乙二醇40(np-40)、曲拉通x-100(triton x-100)等，其用量：重量/体积在1～10％之间。尤其对疏水性强的杂电解质的去除，增加表面活性剂的含量能降低基质复合物对杂电解质的吸附力，有利于杂电解质的去除。

61、-和/或一种或一种以上缓冲化合物，ph值在3～11之间都可以，优先选自，包含但不限于：三(羟甲基)氨基甲烷(tris)、n-(三(羟甲基)甲基)甘氨酸(tricine)、n，n-双(2-羟乙基)甘氨酸(bicine)、n-(2-羟乙基)哌嗪-n′-(2-乙磺酸)(hepes)、哌嗪-1，4-双(2-乙磺酸)(pipes)、n-环己基-2-氨基乙磺酸(ches)、2-(n-吗啉代)乙磺酸(mes)、3-(n-吗啉代)丙磺酸(mops)和/或磷酸盐缓冲剂、醋酸钠缓冲剂、醋酸甲缓冲剂等，优选的是tris、磷酸盐缓冲剂、醋酸钠缓冲剂、醋酸甲缓冲剂，其浓度：1mm～10mm。主要是提供稳定ph值的电泳环境，有利于杂电解质的去除，尤其是在有电流通过的时候，电泳液会发生电解反应，引起电泳液ph值变化。通过添加表面活性剂可以克服这个缺点。

62、-和/或一种或一种以上螯合剂化合物，优先选自，包含但不限于：n-乙酰-l-半胱氨酸、乙二胺四乙酸(edta)、二亚乙基三胺五乙酸(dtpa)、乙二胺-n，n′-二琥珀酸(edds)、1，2-双(邻氨基苯氧基)乙烷-n，n，n′，n′-四乙酸(bapta)和膦酸盐螯合剂(例如包括但不限于次氮基三(亚甲基)膦酸(ntmp)、乙二胺四(亚甲基膦酸)(edtmp)、二亚乙基三胺五(亚甲基)膦酸(dtpmp)、1-羟基亚乙基-1，1-二膦(hedp)等)。优选的是edta、dtpa，其浓度：5mm～100mm。当目标物为dna的时候，需要加入螯合剂化合物，尤其是edta，可以起到稳定dna的作用。

63、-和/或一种和/或一种以上rnase a抑制剂混合物，如：包括但不限于美国专利第6825340号说明书或美国专利第677720号说明书中公开的一些还原剂。在一些实施方案中，常用的rnase a抑制剂为焦碳酸二乙酯(depc)。优选2-巯基乙醇、8-羟基喹啉、depc等。当目标物为rna时，加入rnase a抑制剂混合物可以防止或减缓rna的降解。

64、如权利要求17所述，其特征在于：从权利要求8，9和10中各取其中一种情况和/或一种以上情况，都可以组合形成一种新的去除杂电解质的方法。如：从权利要求8中选择匀强电场，权利要求9中，选择电泳液和真空或稀薄空气，权利要求10中选择带有微孔的口袋，可以组合成一种新的分离方法。接通电源后，杂电解质移向匀强电场两极，而目标物和基质停留在口袋内，起到分离目标物或制备纯的分子探针。

65、如权利要求18所述，其特征在于：胶包含但不限于：琼脂糖凝胶、变性聚丙烯酰胺凝胶(sds-page)、非变性聚丙烯酰胺凝胶(page)等。凝胶的作用：1、让结合目标物的基质停留在凝胶之外。2、吸收杂电解质，如杂蛋白质等。

66、如权利要求19所述，清洗液的组成特征在于：

67、-至少含有h2o。

68、-和/或含有酸，包含但不限于：盐酸、冰醋酸、硫酸等，优选的是盐酸，调节清洗液ph值。

69、-和/或含有碱，包含但不限于：氢氧化钠、tris-base碱等，优选的是tris-base碱，调节清洗液ph值。

70、-和/或含有盐或盐类混合物，包含但不限于：氯化钠、醋酸钠、氯化钾等，优选的是氯化钠，增加清洗液的极性环境，有利于极性杂电解质的去除。

71、-和/或一种或一种以上能溶于水的有机物，优先选自，包含但不限于：甘油、甘氨酸、咪唑等，优选的是甘油，有利于维护蛋白质活性。

72、-和/或一种或一种以上表面活性剂，即阳离子型表面活性剂、阴离子型表面活性剂、两性离子型表面活性剂和/或非离子型表面活性剂。以所述试剂的总体积计，其用量：重量/体积在0～50％之间，优选的是pvp40、np-4)、triton x-100等，其用量：重量/体积在1～10％之间。有利于疏水性强的杂电解质的去除。

73、-和/或一种或一种以上缓冲化合物，ph值在3～11之间都可以，优先选自，包含但不限于：tris、tricinf、bicine、hepes、pipes、ches、mes、mops和/或磷酸盐缓冲剂、醋酸钠缓冲剂、醋酸甲缓冲剂等，优选的是tris、磷酸盐缓冲剂、醋酸钠缓冲剂、醋酸甲缓冲剂，其浓度：1mm～10mm。有利于目标物和基质维持不变的ph环境。

74、-和/或一种或一种以上螯合剂化合物，优先选自，包含但不限于：n-乙酰-l-半胱氨酸、edta、dtpa、edds、bapta和膦酸盐螯合剂(例如包括但不限于ntmp、edtmp、dtpmp、hedp等)。优选的是edta、dtpa，其浓度：5mm～100mm。防止或减缓dna降解。

75、-和/或一种和/或一种以上rnase a抑制剂混合物，如：包括但不限于美国专利第6825340号说明书或美国专利第677720号说明书中公开的一些还原剂。在一些实施方案中，常用的rnase a抑制剂为depc。优选2-巯基乙醇、8-羟基喹啉、dep等。防止或减缓rna降解。

76、如权利要求20所述，分离的活性蛋白包含：酸性蛋白质、中性蛋白质和碱性蛋白质。蛋白质酸碱性的不同，在特定ph值的电泳液中，所带的电荷不同，受到的电场力也不同。但是受到的电场力与目标物与基质的共价键结合力相比来说，可以忽略不计。

77、如权利要求21所述，更具体为0.5％～2％的琼脂糖凝胶，更优的是1％的琼脂糖；更具体为8％～15％sds-page，更优的是10％～12％sds-page；更具体为8％～15％非变性page，更优的是10％～12％非变性sds-page等。合适的凝胶浓度，能起到吸收杂电解质，同时还能把结合目标物的基质停留在凝胶之外。

78、如权利要求22所述，其特征在于：可以大批量处理目标物和基质复合体去除被吸附的杂电解质。

79、具体的实施步骤：

80、a)把基质放入含有目标物的混合物溶液中孵育，使目标物结合到基质上；

81、b)在一次和/或一次以上电场力的作用下，去除杂电解质，保留基质和目标物；

82、c)和/或把目标物从基质上洗脱下来，达到分离或纯化目标物的目的；

83、d)和/或把含有目标物的基质作为整体用于下一步实验

84、本发明提出的一些电场力去除杂电解质的方法及其应用至少能产生如下有益效果：

85、1.操作简单，省时，杂电解质可以瞬间去除；

86、2.被分离和/富集的目标物纯度高；

87、3.外部条件易于控制，有利于生物大分子活性的保持；

88、4.把目标物的分离和/富集过程集于一体；

89、5.大批量分离和富集目标物；

90、6.降低分离和/富集的目标物的成本；

91、7.该方法可以用于分离和/或富集蛋白质、核酸(dna、rna等)、糖(单糖、寡糖和多糖等)等；

92、8.该方法可以在pulldown实验、ip实验、co-ip实验、chip实验、rip实验等，有着广泛的应用。