非洲猪瘟病毒pD205R蛋白的抗原表位肽、单克隆抗体及其应用

本发明属于生物技术与生物医药领域，具体涉及一种非洲猪瘟病毒pd205r蛋白的抗原表位肽及其编码核酸、与非洲猪瘟病毒pd205r蛋白的抗原表位肽特异性结合的单克隆抗体，以及分泌该单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其在制备预防和/或治疗非洲猪瘟病毒感染的药物、检测和/或诊断非洲猪瘟病毒感染的试剂中的应用。

背景技术：

1、非洲猪瘟病毒(asfv)是一种具有高度传染性和破坏性的猪病原体，会引起发烧、呼吸困难、皮肤发绀、淋巴结、肾脏和胃肠粘膜明显出血等临床症状。非洲猪瘟(asf)由asfv感染引起，1921年首次在肯尼亚报道，2018年传入中国，此后蔓延到多个国家，给全球养猪业造成巨大经济损。世界动物卫生组织(woah)将asf列为法定报告动物疫病，家猪的发病率和死亡率接近100％。

2、非洲猪瘟病毒是一种在细胞质中复制的大型双链dna病毒，是asfarviridae家族的唯一成员，也是唯一的dna虫媒病毒。asfv的直径为175-215nm，呈20面体对称，有囊膜，基因组长度为170-190kb，编码超过160种蛋白质。由于asfv的基因组较大，编码的蛋白质复杂，免疫逃逸机制不明晰，截止到目前为止，全球范围内仍没有控制非洲猪瘟传播的商业化疫苗或有效的抗非洲猪瘟病毒药物。因此，在早期快速准确地诊断asfv是防控asf的重要措施。

3、目前，woah已将酶联免疫吸附测定(elisa)作为诊断asf的重要血清学方法，市面上也有几种商业化的elisa试剂盒用于检测asf抗体，其中磷蛋白p30、衣壳蛋白p72、多蛋白pp62和跨膜蛋白p54是基于elisa血清学检测的重要靶点。例如，中国专利申请cn114088940a(中道生物，国昌生物)公开的一种非洲猪瘟病毒elisa抗体检测试剂盒，以p72、p30和p54蛋白共同作为包被抗原(质量比为1:1:1)，能够检出不同时期的抗体。此外，中国专利申请cn115806631a(山东农业大学)还公开了一种非洲猪瘟病毒抗体检测方法，以p30-54-72重组蛋白(包含p30、p54、p72蛋白的优势表位区)作为包被抗原，相较以p30、p54或p72蛋白作为包被蛋白的检测方法具有更高的特异性和敏感性。

4、非洲猪瘟病毒pd205r蛋白是由d205r基因编码的一种非结构蛋白，pd205r蛋白的部分序列与真核生物rna聚合酶ii亚基5(rpb5)相似，并具有该蛋白家族的特征结构域。rpb5与基础转录因子tfiib相互作用，是潜在的转录激活因子相互作用的靶点。同时，asfv也编码类似于tfiib因子的蛋白质，因此推测pd205r参与asfv转录相关过程。且有研究发现，pd205r在asfv感染的巨噬细胞中大量表达，可能在病毒基因转录和mrna加工过程中发挥重要作用。然而，pd205r蛋白的具体生物学功能尚不清楚，对其抗原性进行研究、鉴定可能为开发asfv表位疫苗提供材料基础。

技术实现思路

1、本发明主要解决的技术问题是提供一种非洲猪瘟病毒pd205r蛋白的抗原表位肽。

2、其次，本发明提供一种非洲猪瘟病毒pd205r蛋白的抗原表位肽及其编码核酸在制备预防和/或治疗非洲猪瘟病毒感染的药物、检测和/或诊断非洲猪瘟病毒感染的试剂中的应用。

3、再次，本发明提供一种与非洲猪瘟病毒pd205r蛋白的抗原表位特异性结合的单克隆抗体、以及分泌该单克隆抗体的杂交瘤细胞株。

4、最后，本发明提供一种抗非洲猪瘟病毒pd205r蛋白的单克隆抗体或杂交瘤细胞株在制备预防和/或治疗非洲猪瘟病毒感染的药物、检测和/或诊断非洲猪瘟病毒感染的试剂中的应用。

5、为解决上述技术问题，本发明提供了以下技术方案：

6、一种非洲猪瘟病毒pd205r蛋白的抗原表位肽，所述非洲猪瘟病毒pd205r蛋白的抗原表位肽包含如seq id no：1所示的氨基酸序列。

7、本发明提供的非洲猪瘟病毒pd205r蛋白的抗原表位为线性表位，位于非洲猪瘟病毒pd205r蛋白第167-181位氨基酸(即167-sdppvvwlggrpgdf-181)，其中关键氨基酸为s167、w173、l174、g175、p178和d180。

8、一种非洲猪瘟病毒pd205r蛋白的抗原表位肽的编码核酸。

9、作为本发明一种优选的实施方案，所述编码核酸为dna或rna，在不改变编码氨基酸序列的前提下，可以根据密码子的偏好性进行修饰改造。

10、一种包含非洲猪瘟病毒pd205r蛋白的抗原表位肽或其编码核酸的生物材料。

11、作为本发明一种优选的实施方案，所述生物材料包括但不限于重组表达载体(如质粒载体、病毒载体)、基因表达盒、重组菌、宿主细胞(如原核细胞、真核细胞)。

12、一种非洲猪瘟病毒pd205r蛋白的抗原表位肽或其编码核酸、生物材料的应用，所述应用包括以下任一种或多种：

13、(1)在制备预防和/或治疗非洲猪瘟病毒感染的药物中的应用；

14、(2)在制备检测和/或诊断非洲猪瘟病毒感染的试剂中的应用。

15、一种预防和/或治疗非洲猪瘟病毒感染的药物，所述药物包含以下一种或多种有效成分：

16、(1)非洲猪瘟病毒pd205r蛋白的抗原表位肽；

17、(2)非洲猪瘟病毒pd205r蛋白的抗原表位肽的编码核酸；

18、(3)包含非洲猪瘟病毒pd205r蛋白的抗原表位肽或其编码核酸的生物材料。

19、作为本发明一种优选的实施方案，所述药物为预防和/或治疗性疫苗。具体的，所述疫苗可以为核酸疫苗，其中包含非洲猪瘟病毒pd205r蛋白的抗原表位肽的编码核酸，如dna疫苗、rna疫苗。所述疫苗也可以为多肽疫苗、重组蛋白疫苗或合成长肽疫苗，其中包含非洲猪瘟病毒pd205r蛋白的抗原表位肽。

20、一种检测和/或诊断非洲猪瘟病毒感染的试剂，所述试剂可以为免疫检测和/或诊断试剂，试剂中包含非洲猪瘟病毒pd205r蛋白的抗原表位肽，可用于检测非洲猪瘟病毒感染后产生的能够特异性识别并结合pd205r蛋白的抗原表位肽的抗体。所述试剂也可以为分子检测和/或诊断试剂，试剂中包含检测非洲猪瘟病毒pd205r蛋白的抗原表位肽的编码核酸的引物、探针、分子信标等，均根据该编码核酸设计、合成。

21、作为本发明一种优选的实施方案，所述试剂还可以包含药剂学上可接受的载体、辅料等。对于免疫检测和/或诊断试剂，所述试剂中包含样本稀释液、酶标板、封闭液、洗涤液、底物、终止液、阴性对照、阳性对照等中的一种或多种。对于分子检测和/或诊断试剂，所述试剂中包含聚合酶(依赖rna和/或dna的聚合酶)、扩增反应缓冲液、阳性对照、阴性对照等中的一种或多种。

22、一种抗非洲猪瘟病毒pd205r蛋白的单克隆抗体，所述单克隆抗体由保藏在中国典型培养物保藏中心、保藏编号为cctcc no：c2023250的杂交瘤细胞株asfv-pd205r-19a5(hybridoma cell line asfv-pd205r-19a5)(该部分内容需与保藏证明的信息一致)分泌产生。

23、作为本发明一种优选的实施方案，所述单克隆抗体特异性识别并结合非洲猪瘟病毒pd205r蛋白(氨基酸序列如seq id no：2所示)，尤其是pd205r蛋白的线性表位，位于非洲猪瘟病毒pd205r蛋白第167-181位氨基酸。

24、本发明提供的抗单克隆抗体mab 19a5能够特异性识别并结合非洲猪瘟病毒pd205r蛋白，尤其是识别pd205r蛋白的线性表位(即167-sdppvvwlggrpgdf-181，如seq idno：1所示)，其上6个关键氨基酸位点分别为s167、w173、l174、g175、p178和d180，这与对pd205r蛋白进行结构预测发现的主要配体结合位点(如v172，g175，g176，r177)重合。

25、具体的，所述单克隆抗体的重链型为igm，轻链亚型为kappa。

26、一种用于制备抗非洲猪瘟病毒pd205r蛋白的单克隆抗体的杂交瘤细胞株，所述杂交瘤细胞株保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctcc no：c2023250，保藏名称为杂交瘤细胞株asfv-pd205r-19a5(hybridoma cell line asfv-pd205r-19a5)。

27、具体的，所述杂交瘤细胞株以非洲猪瘟病毒pd205r蛋白(氨基酸序列如seq idno：2所示)为免疫原免疫小鼠制备得到。

28、一种抗非洲猪瘟病毒pd205r蛋白的单克隆抗体、杂交瘤细胞株的应用，所述应用包括以下任一种或多种：

29、(1)在制备预防和/或治疗非洲猪瘟病毒感染的药物中的应用；

30、(2)在制备检测和/或诊断非洲猪瘟病毒感染的试剂中的应用。

31、一种预防和/或治疗非洲猪瘟病毒感染的药物，所述药物包含以下一种或多种有效成分：

32、(1)抗非洲猪瘟病毒pd205r蛋白的单克隆抗体；

33、(2)用于制备抗非洲猪瘟病毒pd205r蛋白的单克隆抗体的杂交瘤细胞株。

34、作为本发明一种优选的实施方案，所述药物可以系统给药或局部给药，剂量为药剂学上可接受的剂量。所述药物的剂型为药剂学上可接受的剂型，可以包含药剂学上可接受的辅料。

35、一种检测和/或诊断非洲猪瘟病毒感染的试剂，所述试剂为免疫检测和/或诊断试剂，包含以下一种或多种有效成分：

36、(1)抗非洲猪瘟病毒pd205r蛋白的单克隆抗体；

37、(2)用于制备抗非洲猪瘟病毒pd205r蛋白的单克隆抗体的杂交瘤细胞株。

38、作为本发明一种优选的实施方案，所述试剂还可以包含药剂学上可接受的载体、辅料等。

39、本发明的有益效果：

40、本发明提供的抗非洲猪瘟病毒pd205r蛋白的单克隆抗体mab 19a5能够特异性识别并结合pd205r蛋白的抗原表位(即167-sdppvvwlggrpgdf-181，其上6个关键氨基酸位点分别为s167、w173、l174、g175、p178和d180)。并且，通过对pd205r蛋白的结构进行预测发现pd205r蛋白上存在几个关键的配体结合位点，包括v172、g175、g176和r177，与单克隆抗体mab 19a5识别pd205r蛋白的关键氨基酸位点重合。本发明提供的单克隆抗体mab 19a5能为进一步研究pd205r蛋白的功能提供科学工具，同时为疫苗的开发以及血清学诊断方法的建立提供新的思路。

41、本发明提供的非洲猪瘟病毒pd205r蛋白的抗原表位在各种asfv菌株和基因型中高度保守，其上存在的v172、g175、g176和r177配体结合位点位于单克隆抗体mab 19a5的抗原表位中，表明该保守表位可以作为asfv血清学检测的良好靶标。该抗原表位与单克隆抗体，以及分泌该单克隆抗体的杂交瘤细胞株可用于制备预防和/或治疗非洲猪瘟病毒感染的药物、检测和/或诊断非洲猪瘟病毒感染的试剂，除此之外，还可用于非洲猪瘟病毒pd205r相关感染机制的研究。