mApple蛋白突变体及其在双标记嵌合分析中的应用

本发明属于基因工程，具体涉及mapple蛋白突变体及其在双标记嵌合分析中的应用。

背景技术：

1、热带爪蛙(xenopus tropicalis)是爪蛙属中唯一具有二倍体遗传背景的两栖类模式动物，具有易饲养，卵直径大，愈合能力强，体外受精，产卵量大，早期胚胎透明等特点，已逐渐发展成为发育生物学、再生医学和遗传学等研究领域的理想模式生物，可应用于发育与再生机制的探究、人类疾病模型研究和疾病靶向药物治疗的筛选。

2、双标记嵌合分析(mosaic analysis with double markers,madm)系统是基于cre诱导的translocation过程能同时实现特定细胞荧光标记、基因敲除及谱系示踪的分子遗传工具。madm系统的基本原理是将两个相互嵌合的标记基因(荧光蛋白)分别定位到同源染色体上的相同位点，其中一个嵌合基因包含绿色荧光蛋白(gfp)的n端和红色荧光蛋白(rfp)的c端(中间由含有loxp位点的内含子相连接)，而另一个嵌合基因包含rfp的n端和gfp的c端(中间由含有loxp位点的内含子相连接)。在没有cre的情况下，不表达功能性的gfp或rfp；但在特定时期、特定细胞中表达cre时，cre能诱导带有两种不同荧光蛋白n端的dna链与另一条带有相同荧光蛋白c端的dna链在细胞有丝分裂g2期发生染色体易位重组，使得两个子代细胞分别表达有任一种有功能性的荧光蛋白(称为：x-segregation)，或者其中一个子代细胞表达两种荧光蛋白而另一种子代细胞不带任何功能性荧光蛋白(称为：z-segregation)。另外，重组也可能发生在细胞周期的g1期或者g0期，在这种情况下，细胞同时表达两种荧光蛋白。

3、在同源染色体上的相同位点敲入该双荧光标记嵌合分析系统，可以通过染色体间重组在体内有效地诱导所有组织中的有丝分裂和有丝分裂后细胞的单荧光或双荧光标记，该方法可以实现在体内体细胞克隆或分离的单细胞中同时标记细胞和基因敲除。当突变位点选定为其中一个标记中时，在进行有丝分裂后，能够通过直接观察不同标记，实现单细胞分辨率的荧光标记突变细胞和另一种荧光标记的同级野生型细胞的表型分析。当使用野生型(即该位点的插入不导致原本的基因表达发生改变)双标记嵌合分析系统时，可以实现动态追踪两个同源细胞(gfp+和rfp+)，通过谱系示踪可以实现对发育过程细胞命运的深入了解。通过双荧光谱系追踪与单细胞水平的表型分析相结合，揭示发育过程和疾病机制的更复杂的细节，对组织器官发育、再生及修复的研究具有重要意义。因此，双荧光标记嵌合分析一旦广泛应用于这些领域，将带来突破性的发现。

4、任何有机荧光团在长时间照射下都会发生不可逆的光漂白，提高荧光蛋白的亮度可以减少筛选荧光标记位点时所需的时间。新型红色荧光蛋白mapple被证实其在斑马鱼胚胎中比其他rfp更加明亮，因此构建含有mapple荧光蛋白的嵌合分析系统可以实现体外和体内高效的红色荧光标记。最近已有科研团队利用mapple作为红色荧光标记，egfp作为绿色荧光标记，构建了适用于斑马鱼模式动物的双荧光标记嵌合分析系统(zmadm)，并利用双荧光标记系统在双谱系追踪与单细胞水平的表型分析的优势，成功获得斑马鱼视顶盖神经元柱细胞的不对等分裂的证据，进一步证实了zmadm系统在水生动物器官发育机制研究领域的独特优势(zmadm(zebrafish mosaic analysis with double markers for single-cell gene knockout and dual-lineage tracing,2022,119(9):e2122529119)。

5、为了进一步探索zmadm系统是否能在热带爪蛙模型中有效工作，发明人首先克隆了上述研究中zmadm系统的嵌合基因片段(n-egfp::c-mapple,ga；n-mapple::c-egfp,ag)，并将其连接到pcag-egfp载体(由pbs-t2a-egfp-bghpa载体(见本实验室已发表文章：29897811)经本实验室改造所得)中cag启动子下游的bamhi与ecori酶切位点之间，替换原有egfp片段，进而构建pcag-ga，以及pcag-ag表达载体。然而，将上述载体转染293t细胞进行功能验证时，我们发现转染pcag-ga和pcag-cre载体(addgene,#13775，经本实验室改造)的细胞没有绿色荧光表达，但有红色荧光表达(gfp-/rfp+)；转染pcag-ag和pcag-cre载体的细胞没有任何荧光表达(gfp-/rfp-)；pcag-ga、pcag-ag和pcag-cre三个载体共同转染的293t细胞中既有绿色荧光又有红色荧光表达(gfp+/rfp+)，而且表达红色荧光的细胞数量远高于表达绿色荧光的细胞数量。上述结果表明：pcag-ga表达载体转染细胞后发生红色荧光泄露，这将严重影响利用上述zmadm系统进行细胞命运示踪及进行单细胞水平表型分析的精确性与可靠性。

技术实现思路

1、本发明的目的在于克服现有基于mapple作为红色荧光标记蛋白的zmadm系统存在荧光泄露问题的缺点与不足，提供一种无荧光泄露的双标记嵌合分析系统。

2、本发明的另一方面是提供两组mapple蛋白n端截短型突变体。

3、本发明的目的通过以下技术方案实现：

4、一种无荧光泄露的双标记嵌合分析系统，命名为madm2.0，包括cre重组酶载体，双标记嵌合片段1载体和双标记嵌合片段2载体，其中：

5、所述的双标记是指绿色荧光蛋白egfp和红色荧光蛋白mapple，其核苷酸序列分别如seq id no:1、seq id no:2所示；

6、所述的双标记嵌合片段1由绿色荧光蛋白egfp的n端1位～274位碱基与红色荧光蛋白mapple的c端61位～711位碱基通过含有loxp位点的内含子相连接得到；所述的双标记嵌合片段2由红色荧光蛋白mapple的n端1位～60位碱基与绿色荧光蛋白egfp的c端275位～720位碱基通过含有loxp位点的内含子相连接得到；

7、或者，所述的双标记嵌合片段1由绿色荧光蛋白egfp的n端1位～274位碱基与红色荧光蛋白mapple的c端73位～711位碱基通过含有loxp位点的内含子相连接得到；所述的双标记嵌合片段2由红色荧光蛋白mapple的n端1位～72位碱基与绿色荧光蛋白egfp的c端275位～720位碱基通过含有loxp位点的内含子相连接得到。

8、进一步地，所述的双标记嵌合片段1载体、双标记嵌合片段2载体的核苷酸序列分别如seq id no:3、seq id no:4所示。

9、进一步地，所述的双标记嵌合片段1载体、双标记嵌合片段2载体通过如下方法制备得到：

10、s1、分别以质粒序列数据库addgene中编号为#182155的ptol2-eab2-ag载体中的ag嵌合基因片段的dna序列为模板，以质粒序列数据库addgene中编号为#182156的ptol2-eab2-ga载体中的ga嵌合基因片段的dna序列为模板，进行基因合成，并连接到pcag-egfp载体的bamhi与ecori酶切位点之间，构建pcag-ga表达载体和pcag-ag表达载体；

11、s2、以红色荧光蛋白mapple的n端截短型突变体c-mapple-2或c-mapple-3的dna序列为模板，进行基因合成，并替换pcag-ga表达载体的c-mapple，构建双标记嵌合片段1载体，命名为pcag-ga2.0表达载体；以缺失的片段为模板(c-mapple-2为57bp，c-mapple-3为69bp)，进行基因合成，并插入pcag-ag表达载体n-mapple下游，构建双标记嵌合片段2载体，命名为pcag-ag2.0表达载体。

12、进一步地，所述的cre重组酶载体选自pcag-cre载体或改造后的pcag-cre载体。

13、更进一步地，所述的改造后的pcag-cre载体通过如下方法制备得到：以质粒序列数据库addgene中编号为#13775的pcag-cre载体中的cre基因片段的dna序列为模板，进行基因合成，并连接到pcag-egfp载体的bamhi与ecori酶切位点之间，构建pcag-cre表达载体。

14、mapple蛋白n端截短型突变体，与原zmadm系统的嵌合基因中mapple蛋白n端c-mapple的氨基酸序列seq id no:8相比，所述mapple蛋白n端截短型突变体中存在以下突变中的至少一种：

15、1)缺失n端19个氨基酸序列(即c-mapple-2，氨基酸序列如seq id no:8的第20位～235位氨基酸所示)；

16、2)缺失n端23个氨基酸序列(即c-mapple-3，氨基酸序列如seq id no:8的第24位～235位氨基酸所示)。

17、核酸分子，为编码上述mapple蛋白n端截短型突变体的核酸分子。

18、进一步地，编码1)中mapple蛋白n端截短型突变体的核酸分子的核苷酸序列如seqid no:9的第58位～708位碱基所示；编码2)中mapple蛋白n端截短型突变体的核酸分子的核苷酸序列如seq id no:9的第70位～708位碱基所示。

19、生物材料，为含有上述核酸分子的生物材料，所述生物材料为重组dna、表达盒、转座子、质粒载体、病毒载体或工程菌。

20、相互嵌合基因组，包含上述双标记嵌合片段1和双标记嵌合片段2。

21、上述双标记嵌合分析系统、mapple蛋白n端截短型突变体、核酸分子、生物材料或相互嵌合基因组在双标记嵌合分析中的应用。

22、上述双标记嵌合分析系统在双谱系追踪和/或单细胞水平表型分析中的应用。

23、进一步地，所述的应用为在热带爪蛙早期胚胎水平表型分析中的应用。

24、进一步地，所述的应用的操作为：

25、s11、以质粒序列数据库addgene中编号为#61391的pcs2-cre载体为模板，在体外转录cre的mrna，纯化得到cremrna；

26、s12、将cremrna，双标记嵌合片段1载体和双标记嵌合片段2载体制备成注射混合液，注射到热带爪蛙受精卵的动物极，注射后的受精卵放置于胚胎培养液中孵育，利用荧光体式显微镜筛选出表达荧光的f0胚胎。

27、本发明的技术思路：为了使zmadm系统更精确可靠地应用于发育和疾病机制研究领域，发明人对pcag-ga表达载体中的ga嵌合基因片段进行编码框、结构域和序列分析，发现其中ga片段中的内含子中有多个剪接相似位点，以及c-mapple片段相对于完整的mapple基因序列只删除了起始密码子atg三个碱基序列，mapple的发色团及其β罐保护结构完整，而且c-mapple片段的前70个碱基序列中包含多个atg起始密码子序列，其中含有kozak相似序列。因此发明人对产生荧光泄露的细胞进行rna提取后进行反转录以及扩增n-egfp::c-mapple片段并测序，验证内含子剪接的精确性。接着，发明人通过截短mapple片段n端参与形成β罐一端的“帽子”结构的6个氨基酸合成c-mapple-1，并将其连接到含cag但无kozak序列的表达载体框架上进行功能验证。最后，发明人构建了缺失c-mapple片段5’端不同位点的atg的多个截短体的表达载体并进行功能验证，探究pcag-ga表达载体发生红色荧光泄露的原因。实验结果表明，pcag-ga表达载体中ga之间的内含子剪接正确，且mapple在缺失kozak序列、n端atg和参与形成β罐一端的“帽子”结构的6个氨基酸后仍能产生红色荧光。通过c-mapple截短体验证发现，发生荧光泄露的原因可能是c-mapple片段的n端的kozak类似序列使其后面的atg在翻译过程中被识别为起始密码子，从而使c-mapple表达出n端缺少部分氨基酸但仍然能够表达红色荧光的蛋白突变体，进而造成红色荧光泄露。

28、进一步地，本发明利用缺失突变技术、内含子剪接原理和嵌合基因移码突变原理，创新性地构建了两种新型无荧光泄露的相互嵌合基因ga2.0和ag2.0，并证实该系统可在哺乳动物细胞及热带爪蛙模型中实现更加精确的细胞命运示踪及单细胞水平的表型分析研究。

29、本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

30、本发明创造性地制备了红色荧光蛋白mapple的两套突变体(n-mapple突变体：n-mapple-2和n-mapple-3；c-mapple突变体：c-mapple-2和c-mapple-3)，并利用该突变体构建了一个更加精确、无荧光泄露的具有双谱系追踪与单细胞水平表型分析能力的madm系统(madm2.0)。根据内含子剪接原理以及真核生物翻译相关序列的分析，在保留双荧光嵌合基因载体剪接移码突变的基础上，对原始zmadm系统的两个嵌合基因进行重构，解决了原始zmadm系统红色荧光泄露的问题，不仅保留了其在双谱系追踪和单细胞水平表型分析的示踪优势，同时提高了其作为揭示发育过程和疾病机制更复杂的细节的一种有效工具的准确性和可靠性，并且证实了新制备的madm2.0系统可应用于热带爪蛙模型研究，对利用热带爪蛙模型开展发育生物学和再生生物学的研究具有重要意义。