一种减少接头二聚体的小RNA建库方法及应用

本发明属于核酸测序，具体涉及一种减少接头二聚体的小rna建库方法及应用。

背景技术：

1、small rna作为一种生命活动重要的调控因子，在基因表达调控、生物个体发育、代谢及疾病的发生等生理过程中起着重要的作用。使用下一代测序技术的小rna测序(srna-seq)是已知或未知小rna序型分析和发现的重要研究手段。然而由于rna输入量高(10ng)、建库偏差大、手工凝胶纯化繁琐等原因，小rna文库制备方案迄今为止一直受到限制。

2、小rna文库的制备方法主要集中在防止或消耗一种被称为接头二聚体的副产物。接头二聚体具有完整的接头序列，因此可以被扩增和测序。一方面，由于它们的大小比目标文库片段要短(约20bp)，它们会比目标文库片段更有效地扩增，尤其是rna样本量较低时；另一方面，由于接头二聚体和目标文库片段的长度差异小，这使得目标文库片段的分离和纯化非常困难，进而产生大量无用的测序数据，影响测序数据质量。因此，减少接头二聚体产物是成功产生测序文库的关键方面。

3、目前，多种方法已被用于减少接头二聚体产物。其中最普遍被使用的方法是互补寡核苷酸杂交策略，该策略在srna第一步连接完成之后将引物探针退火杂交到3’接头上，这使过量的3’接头从单链dna转化为双链平末端dna。双链dna不易被第二步连接反应中使用的t4rna连接酶1识别，从而抑制接头二聚体产物的形成。srna文库构建的传统方法已被证明具有严重的偏差，这导致测序结果无法准确地计算目标小rna的相对丰度。使用在连接接合处具有随机碱基的接头探针能大大减小建库偏差。然而，当使用具有随机碱基末端的接头探针进行小rna建库时，互补寡核苷酸杂交策略无法有效减少接头二聚体的形成。因此，发展一种适用于具有随机碱基末端接头的有效减少接头二聚体的小rna建库方法仍旧是一个迫切需求和重大挑战。

技术实现思路

1、为了克服上述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种减少接头二聚体的小rna建库方法及应用，以解决现有技术中由于接头二聚体导致的小rna建库测序文库质量低下的问题，从而现小rna的精准建库和测序。

2、为了达到上述目的，本发明采用以下技术方案予以实现：

3、本发明公开了一种减少接头二聚体的小rna建库方法，包括以下步骤：

4、1)设计用于测序文库构建的接头探针序列，包括3’接头探针序列和5’接头探针序列；

5、2)将含有靶核酸的样品、3’接头探针序列和连接酶a一同进行孵育，完成第一步连接反应；

6、3)向步骤2)处理后的反应体系中添加逆转录引物探针，该逆转录引物探针与3’接头探针序列的部分区域序列互补配对，进行特异性杂交，然后添加dna聚合酶，以逆转录引物探针为引物进行dna聚合反应；

7、4)向步骤3)处理后的反应体系中添加5’接头探针序列和连接酶b，然后进行孵育，完成第二步连接反应；

8、5)向步骤4)处理后的反应体系中添加限制性核酸内切酶，进行靶向酶切反应，然后再进行pcr扩增反应。

9、优选地，步骤1)中，3’接头探针序列以5’端向3’端的方向设计有随机碱基区域和限制性内切酶识别区域，3’端为ddc修饰，5’端为p修饰，且限制性内切酶识别序列为6-10nt。

10、优选地，步骤1)中，5’接头探针序列计为全rna碱基探针，或者设计为5’端为dna碱基、3’端不少于20nt rna碱基的核酸探针，5’接头探针序列在3’端设计有随机碱基区域，3’端和5’端均为-oh。

11、优选地，步骤1)中，3’接头探针序列和5’接头探针序列上随机碱基序列之和为1-25nt。

12、优选地，连接酶a采用t4rna连接酶2或截短的t4rna连接酶2；dna聚合酶采用phi29dna聚合酶或t4 dna聚合酶；连接酶b采用t4rna连接酶1、热自养甲烷杆菌rna连接酶或rtcb连接酶。

13、优选地，步骤2)中，第一步连接反应的产物为5’rna碱基、3’dna碱基的核酸链，未连接的3’接头探针序列为全dna碱基的核酸链；

14、第一步连接反应的产物转化为包含5’单链悬垂部分的3’接头-寡核苷酸双链体，其5’悬垂部分包括rna碱基和dna碱基；未连接的3’接头转化为包含5’单链悬垂部分的3’接头-寡核苷酸双链体，其5’悬垂部分为dna碱基。

15、进一步优选地，步骤3)中，添加的dna聚合酶将未连接的3’接头转化为双链寡核苷酸，第一步连接产物已经转化为包含5’单链悬垂部分的3’接头-寡核苷酸双链体，其5’单链悬垂部分的rna碱基区域不会被dna聚合酶当作模板识别。

16、优选地，步骤5)中，限制性核酸内切酶的切割位点为dna碱基，限制性内切酶采用type iis或者type iii型限制性内切酶，识别区域与切割区域不在同一位点。

17、进一步优选地，限制性核酸内切酶识别3’接头探针序列上的内切酶识别区域，酶切下游25/27nt的位置；目标产物在此位置的序列为rna碱基，不会被内切酶酶切；而接头二聚体在此位置的序列为dna碱基，会被内切酶酶切，无法在后续的pcr反应中进行扩增反应。

18、本发明还公开了上述的减少接头二聚体的小rna建库方法在核酸测序中的应用。

19、与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

20、本发明公开的减少接头二聚体的小rna建库方法，一方面，dna聚合酶会在第二步连接反应前将未连接的3’接头转化为双链寡核苷酸，从而阻止5’接头探针与3’接头探针直接连接，抑制接头二聚体的产生；另一方面，限制性核酸内切酶会识别3’接头探针上的内切酶识别位点，切割下游相对应的酶切位点，接头二聚体因为对应的酶切位点为dna碱基所以会被内切酶酶切，从而实现对接头二聚体产生后的消除，最终实现小rna测序文库中接头二聚体的减少。因此本发明的优势十分明显：

21、1)通过本发明提供的方法，在不影响目标靶核酸样本文库构建的情况下,有效减少接头二聚体。该方法能够显著降低测序文库接头比例，实现小rna的精准建库和测序；

22、2)该方法的有效性好，文库构建偏差小。具有随机化末端的连接接头可以减少连接偏差，提高靶核酸样本的建库效率；另外，测序文库中接头二聚体占比的降低也会提高目标文库片段的扩增效率，提高文库测序有效数据；

23、3)该方法操作简单，常规的聚合实验操作及酶切实验操作即可完成，无需割胶纯化，磁珠纯化或者柱纯化等纯化操作；

24、4)该方法具有普适性，对于通过两端连接接头的文库构建方法，无论是具有或不具有随机化末端的连接接头，该发明提供的减少接头二聚体的方法均适用。

技术特征：

1.一种减少接头二聚体的小rna建库方法，其特征在于，包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的减少接头二聚体的小rna建库方法，其特征在于，步骤1)中，3’接头探针序列以5’端向3’端的方向设计有随机碱基区域和限制性内切酶识别区域，3’端为ddc修饰，5’端为p修饰，且限制性内切酶识别序列为6-10nt。

3.根据权利要求1所述的减少接头二聚体的小rna建库方法，其特征在于，步骤1)中，5’接头探针序列计为全rna碱基探针，或者设计为5’端为dna碱基、3’端不少于20nt rna碱基的核酸探针，5’接头探针序列在3’端设计有随机碱基区域，3’端和5’端均为-oh。

4.根据权利要求1所述的减少接头二聚体的小rna建库方法，其特征在于，步骤1)中，3’接头探针序列和5’接头探针序列上随机碱基序列之和为1-25nt。

5.根据权利要求1所述的减少接头二聚体的小rna建库方法，其特征在于，连接酶a采用t4rna连接酶2或截短的t4rna连接酶2；dna聚合酶采用phi 29dna聚合酶或t4 dna聚合酶；连接酶b采用t4rna连接酶1、热自养甲烷杆菌rna连接酶或rtcb连接酶。

6.根据权利要求1所述的减少接头二聚体的小rna建库方法，其特征在于，步骤2)中，第一步连接反应的产物为5’rna碱基、3’dna碱基的核酸链，未连接的3’接头探针序列为全dna碱基的核酸链；

7.根据权利要求6所述的减少接头二聚体的小rna建库方法，其特征在于，步骤3)中，添加的dna聚合酶将未连接的3’接头转化为双链寡核苷酸，第一步连接产物已经转化为包含5’单链悬垂部分的3’接头-寡核苷酸双链体，其5’单链悬垂部分的rna碱基区域不会被dna聚合酶当作模板识别。

8.根据权利要求1所述的减少接头二聚体的小rna建库方法，其特征在于，步骤5)中，限制性核酸内切酶的切割位点为dna碱基，限制性内切酶采用type iis或者type iii型限制性内切酶，识别区域与切割区域不在同一位点。

9.根据权利要求8所述的减少接头二聚体的小rna建库方法，其特征在于，限制性核酸内切酶识别3’接头探针序列上的内切酶识别区域，酶切下游25/27nt的位置；目标产物在此位置的序列为rna碱基，不会被内切酶酶切；而接头二聚体在此位置的序列为dna碱基，会被内切酶酶切，无法在后续的pcr反应中进行扩增反应。

10.权利要求1～9中任意一项所述的减少接头二聚体的小rna建库方法在核酸测序中的应用。

技术总结
本发明公开了一种减少接头二聚体的小RNA建库方法及应用，可以从抑制形成和形成后消除两个方面减少接头二聚体，实现对小RNA的高效建库。该建库方法中减少接头二聚体的步骤包括:核酸探针接头设计，DNA聚合酶聚合反应和限制性内切酶酶切反应。该建库方法可特异性抑制接头二聚体的文库构建，阻止接头二聚体在后续PCR反应中被扩增，显著降低文库接头二聚体比例，提高目标文库的扩增效率，实现小RNA的精准建库和测序。

技术研发人员：赵永席,陈锋,余骅航
受保护的技术使用者：西安交通大学
技术研发日：
技术公布日：2024/3/17