一种基于微粘度分子转子的高通量筛选胞外多糖高产菌株的方法

本发明属于食品生物，具体涉及一种基于微粘度分子转子的快速高通量筛选高产胞外多糖菌株的方法。

背景技术：

1、近年来微生物胞外多糖(eps)因其广泛的应用而受到关注，尤其是乳酸菌(lab)产生的eps。这些eps表现出相当大的结构和物理化学多样性，具有许多潜在的功能活性，如抗氧化，抗微生物，抗癌，伤口愈合，免疫调节和益生元性能。乳酸菌胞外多糖是这类细菌生长代谢过程中分泌到细胞壁外的黏液或荚膜多糖。胞外多糖具有独特的物理学特性、良好的流变学特性和生物学活性且乳酸菌被认为是安全的食品级微生物，因此筛选高产胞外多糖的菌株已成为一个研究和应用热点。

2、一般情况下，筛选产多糖的菌株需要提取、测定多糖的含量，这个过程主要包括：(1)通过离心或过滤等方法去除发酵体系中的菌体细胞；(2)向去除菌体细胞的发酵液中加入能与水互溶但不能溶解多糖的沉淀剂(如甲醇、乙醇、异丙醇等)，使多糖从发酵液中沉淀出来；(3)离心得到多糖沉淀，即粗多糖；(4)将粗多糖溶解，进一步测定含量，如采用苯酚-硫酸法，多糖在硫酸的作用下先水解成单糖，并迅速脱水生成糖醛衍生物，然后与苯酚生成橙黄色化合物，再以比色法测定。这一过程相当繁琐又费力、费时，对于筛选菌株工作，效率极低。因此，发现新的更简便、快速的高产胞外多糖菌株的方法尤为重要。

3、荧光分子转子(molecular rotors)是指一类含有电子供体和受体的化合物，通过π-共轭结合，在受到光激发时会发生内部旋转。当分子吸收光的时候，会产生荧光，进入到激发单态，释放光子回到基态。对于分子转子来说，在光激发之前，局部激发态(le)形成分子内电荷转移(tict)态，由受体和供体间的静电相互作用驱动。当环境的微黏度增加时，这些化合物的分子旋转会受到限制，易于回到激发态，阻碍tict状态的形成并增加荧光发射强度。三芳基甲烷合成染料，如品红、孔雀绿、甲基紫、结晶紫等，具有分子转子特性，比如流动性、光物理特性与探针周围的分子拥挤程度有关。

4、传统的多糖提取、测试比较费时、破坏样品，而荧光技术快速、无损、可以提供微观或宏观特性，还能实现在线监测。因此本专利利用分子转子探索荧光技术用来更高效地研究微生物发酵体系的多糖凝胶机械特性。采用结晶紫作为多糖体系的嵌入式传感器，荧光数据结合传统的流变学检测，建立一种快速评估微生物产胞外多糖能力的高通量方法。

技术实现思路

1、发明目的：本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一种基于微粘度分子转子的快速高通量筛选胞外多糖高产菌株的方法。

2、为了解决上述技术问题，本发明公开了一种基于微粘度分子转子的快速高通量筛选胞外多糖高产菌株的方法。本发明采用的技术方案如下：

3、一种基于分子转子的高通量筛选胞外多糖高产菌株的方法，包括以下步骤：

4、(1)将分子转子溶于水，得到分子转子水溶液；

5、(2)微生物发酵得到发酵液，发酵液离心得到上清液；

6、(3)将所述的分子转子水溶液与所述的上清液混合，得到混合液；

7、(4)测定所述混合液的归一化荧光强度，选择归一化荧光强度高的菌株为胞外多糖高产菌株。

8、其中，步骤(1)中，所述的分子转子为微粘度分子转子。

9、所述的分子转子为三芳基甲烷染料，优选地，所述的三芳基甲烷染料包括品红、孔雀绿、甲基紫或结晶紫中的任意一种或多种的组合。最优选地，所述的分子转子为结晶紫。

10、其中，步骤(1)中，所述的分子转子水溶液，溶剂为水，优选去离子水。优选地，分子转子水溶液为结晶紫水溶液，所述的结晶紫水溶液利用市售的0.1％结晶紫原液与去离子水混合配制。所述的市售的0.1％结晶紫原液，每100ml水溶液中溶解0.1g结晶紫。

11、其中，步骤(1)中，所述的分子转子水溶液，其分子转子浓度为45-55μm。优选地，分子转子浓度为50μm。

12、其中，步骤(2)中，所述的微生物为具有胞外多糖生产能力的细菌或真菌中的一种或多种的组合。优选地，所述的微生物为细菌。最优选地，所述的微生物为乳酸菌科微生物，包括乳杆菌属、肠球菌属、片球菌属等，如鼠李糖杆菌(lactobacillus rhamnosus)、副干酪乳杆菌(lactobacillus paracasei)、发酵乳杆菌(lactobacillus fermentum)、海氏肠球菌(enterococcus hirae)、短乳杆菌(lactobacillus brevis)、戊糖乳杆菌(lactobacillus pentosus)、母鸡乳杆菌(lactobacillus gallinarum)、植物乳杆菌(lactobacillus plantarum)或戊糖片球菌(pediococcus pentosaceus)等中的任意一种或多种的组合。

13、本发明所述的筛选方法不受限于何种菌株，只要具有胞外多糖生产能力的菌株均适用于本方法。

14、所述的乳酸菌科微生物的发酵条件为：将-20℃或-80℃冷冻保存的菌种室温解冻，按2％v/v接种量接种到mrs液体培养基中，36-38℃培养活化48～54h。优选地，活化方法为：将-20℃保存于20％v/v甘油中的菌种，室温解冻后按2％v/v接种量于mrs液体培养基中37℃培养活化48h。将活化后的菌液再按2％v/v接种量转接到mrs培养基中37℃培养48h获得发酵液。

15、其中，mrs液体培养基配方为：蛋白胨9.5-10.5g/l，酵母膏4.8-5.2g/l，牛肉浸膏9.8-10.2g/l，k2hpo4 1.9-2.1g/l，mgso4·7h2o 0.55-0.60g/l，mnso4·4h2o 0.25-0.28g/l，柠檬酸二铵1.9-2.1g/l，乙酸钠4.9-5.1g/l，葡萄糖19.8-20.1g/l，吐温80 0.95-1.1ml/l。优选地，mrs液体培养基配方为：蛋白胨10.0g/l，酵母膏5.0g/l，牛肉浸膏10.0g/l，k2hpo42.0g/l，mgso4·7h2o 0.58g/l，mnso4·4h2o 0.25g/l，柠檬酸二铵2.0g/l，乙酸钠5.0g/l，葡萄糖20.0g/l，吐温80 1.0ml/l，ph 6.8，121℃灭菌20min。

16、其中，步骤(2)中，发酵液离心条件为：4℃，1500～2000rpm，离心5～6min，获得上清液。优选地，4℃，2000rpm，离心5min。

17、其中，步骤(3)中，所述混合液中分子转子终浓度为0.5～25μm。所述的上清液与所述的分子转子水溶液按体积比1:1～99:1的比例混合以实现分子转子终浓度为0.5～25μm。

18、其中，步骤(3)中，所述的混合液中分子转子终浓度为4～6μm。优选地，分子转子终浓度为5μm，此时，所述的上清液与所述的分子转子水溶液体积比为9:1。

19、其中，步骤(4)中，所述的混合液的归一化荧光强度，将混合液样品的相对荧光强度除以同批次样品中的相对荧光强度最大值；所述的相对荧光强度，为混合液的荧光强度减去上清液和空白对照的荧光强度；所述的空白对照为分子转子水溶液的荧光轻度减去溶剂水的荧光强度。其中，空白对照所使用的分子转子水溶液的浓度与混合液中分子转子终浓度相同。

20、其中，步骤(4)中，使用荧光分光光度计测定荧光强度，扫描条件为570nm激发波长下收集590nm至800nm的发射光谱；激发和发射狭缝均为10.0nm；扫描速度为5nm/s。

21、其中，步骤(4)中，得到的胞外多糖高产菌株为同批次待测菌株中归一化荧光强度在前10％～15％的菌株，将初筛得到的前10％～15％的菌株用传统胞外多糖检测方法进一步复筛，得到同批次待测菌株中胞外多糖生产能力最强的菌株。

22、有益效果：

23、采用结晶紫作为多糖体系的嵌入式传感器，根据荧光光谱数据建立一种快速评估微生物产胞外多糖能力的高通量方法。

24、1、本发明筛选得到一种可以快速高通量评估微生物发酵产胞外多糖的分子转子探针。

25、2、本发明基于荧光技术，结合多糖体系下分子转子荧光强度增强的特性，用来评估微生物发酵产胞外多糖的能力。

26、3、本发明技术操作简单快速，只需混合发酵液和分子转子探针后进行荧光光谱扫描，不需要进行发酵液中多糖的提取和测定，效率是传统提取、测定方法的数十倍，适用于高通量筛选菌株。传统胞外多糖检测方法需要将多糖从发酵液中沉淀得到粗多糖，再用粗多糖溶解进行检测(如苯酚-硫酸法检测)，该方法处理时间达到36～48h。相较于传统检测方法，本发明只需将发酵液与分子转子水溶液混合测定混合液荧光强度即可，显著提高检测效率。

27、4、本发明技术准确，通过高通量筛选得到的菌株均为胞外多糖生产能力强的菌株。

28、5、本发明技术绿色、简便，不需要使用传统提取、测定方法的乙醇、苯酚、浓硫酸等化学试剂，成本低、操作简单、安全绿色。