绿僵菌绿色色素A及其提取方法与流程

本发明涉及生物制品的提取，尤其涉及绿僵菌绿色色素a及其提取方法。

背景技术：

1、绿僵菌是一种可感染多种昆虫但对哺乳动物没有感染性的真菌，是自然界中广泛存在的孢子呈现绿色的真菌。

2、色素是真菌的重要代谢产物，与真菌的环境适应性有重要关系，同时在人类生活中扮演着重要的角色。目前各种天然色素已经运用到了人类生活的各个方面，包括衣服、食物、化妆品、环境装饰等，人类生活已经变得真正的丰富多彩。许多考古证据表明，自古以来就有使用色素作为着色剂的工艺。自19世纪合成色素被发现以来，由于其生产成本低、生产容易、着色性好等特点，使其在不同行业中有着广泛应用。然而，随着研究的深入，合成色素已被发现对人类健康和环境有许多不利影响。由于合成色素有着降解差、持久性差、可能致癌/过敏等的许多缺点，导致天然有机色素成为研究的热点。

3、天然色素是主要由植物、动物和微生物代谢产生的色素。自古以来，多数广泛应用的天然色素都是从植物中提取的，如红木、葡萄、靛蓝、甜菜根、姜黄、茜草、藏红花等。然而，从植物中提取色素并不是一个高效的选择，植物对生活环境要求较高，对季节有严重的依赖性。提取成本高以及稳定性和溶解性问题导致植物色素提取效率较低。如今，随着微生物培养技术的发展，包括细菌、真菌和藻类在内的微生物已被证明是天然色素的一种优质的替代来源。由于真菌易于在廉价介质中快速生长，不受外界环境影响等因素使其成为天然色素的极佳生产者之一。

4、授权公告号为cn114106069b的专利中公开了一种具有抑制糖苷酶活性的类绿僵菌素a和类绿僵菌素b及提取方法，该技术中公开了从绿僵菌中提取类绿僵菌素a和类绿僵菌素b的方法，并对其物理化学性质进行了鉴定。

5、授权公告号为cn112778797b的专利中公开了一种使用甲酸提取绿僵菌中的天然绿色色素的方法，其解决了绿僵菌绿色真菌色素无法提取的问题，为进一步的结构鉴定和利用奠定了基础，但是，该技术并没有研究天然绿色色素的结构，同时，该方法中使用的提取剂为甲酸，甲酸可使真菌细胞壁溶解，但反应相对较强，会在提取液中引入细胞壁成分相关杂质。

6、另外，高效氯氰菊酯与绿僵菌复配对德国小蠊防治机制的研究.山东师范大学，硕士学位论文；重组罗伯茨绿僵菌光解酶的构建及功能研究，浙江大学，硕士学位论文；蝗绿僵菌c2h2转录因子mavrf1的功能研究，重庆大学，硕士学位论文；液泡精氨酸输出基因vae的失活导致罗伯茨绿僵菌培养退化的机制研究，浙江大学，博士学位论文；metarhiziumrobertsiimrabaaaffectsconidial pigmentationviaregulatingmrpks1andmrmlac1expression，journalofinvertebrate pathology，volume197，issue，2023，pp107892-107892。上述论文中均涉及绿僵菌的相关研究，但是均没有涉及绿僵菌绿色色素分子结构的内容。

技术实现思路

1、有鉴于此，本发明提出了绿僵菌绿色色素a及其提取方法，获得了绿僵菌绿色色素a的纯品，解决了绿僵菌绿色色素分子结构未被解析的难题。

2、本发明的技术方案是这样实现的：

3、第一方面，本发明提供了绿僵菌绿色色素a，结构式如下：

4、

5、第二方面，本发明提供了从绿僵菌中提取绿僵菌绿色色素a的方法，包括如下步骤：

6、步骤一菌种筛选

7、使用平板培养基培养绿僵菌菌种，跟据菌落颜色选取菌落绿色色素产量最高的绿僵菌。

8、本发明中的绿僵菌菌种选自安徽省微生物防治重点实验室中培养的绿僵菌菌种；绿色色素产量的高低是通过人工判断绿色程度的深浅，绿色色素产量最高的菌种即绿色程度最深的绿僵菌。

9、步骤二扩大培养及孢子收集

10、将筛选出的绿僵菌的孢子接种于pda液体培养基摇瓶培养，作为种子培养基。配置大米培养基，将种子培养基接种于大米培养基中进行大量培养，培养10-15天至大米表面布满绿色孢子。使用收孢机收集孢子，存于4℃冰箱备用。

11、步骤三酶解前处理

12、按重量体积比1g:5～7ml，在孢子中加入酶解前处理试剂，搅拌均匀，温度10～50℃、超声提取20～400分钟，然后过滤或离心。

13、步骤四细胞壁的酶处理

14、以纤维素酶溶液：蜗牛酶溶液：几丁质酶溶液按照体积比为(0.5-1.5)：(0.5-1.5)：(0.5-1.5)混合成细胞壁酶解液，对经过酶解前处理的孢子的细胞壁进行酶解处理。

15、由于绿僵菌为真菌，真菌细胞壁主要由几丁质、纤维素和聚糖构成，使用纤维素酶溶液、蜗牛酶溶液、几丁质酶溶液可以分解真菌的细胞壁。

16、步骤五粗提物的制备

17、将酶解处理后的孢子按重量体积比1g:5～7ml加入苯酚提取剂，搅拌或提取2～8小时，过滤或离心分离，得到色素粗提液，将色素粗提液在在真空度-0.05～0.2mp、温度85～95℃条件下减压蒸去提取剂，在-45～55℃条件下干燥，得到绿色色素粗提物。

18、本发明首先通过酶解反应分解细胞壁，酶解反应较为温和，细胞壁酶解后，再使用苯酚提取，可在保证色素提取的前提下，引入较少的杂质，有利于后续的纯化及结构鉴定。

19、步骤六绿色色素的分离

20、将羟丙基葡聚糖凝胶(sephadexlh-20)填料使用含甲醇溶液溶胀过夜，弃掉上层漂浮的颗粒后装柱，冲洗3-5个柱体积后加入色素样品进行洗脱，流速调至9秒/滴。按照颜色进行收集，收集到组分1-5，组分1再次使用sephadexlh-20分离得到色素纯化品12mg。在真空度-0.1mp、温度15℃条件下减压蒸去提取剂，在-50℃条件下干燥，得到绿色色素。

21、步骤七绿僵菌绿色色素a纯品的制备

22、选用安捷伦zorbaxsb-c18色谱柱，使用超纯水作为a相，甲醇作为b相。洗脱方法：使用0-18min，27％b等度洗脱；18-20min，27％-100％b，20-30min，100％b等度洗脱，30-32min，100％-27％b。紫外检测器扫描波长为266nm和340nm，收集在两个波长下同时出峰的成分。将收集液在真空度-0.1mp、温度15℃条件下减压蒸去提取剂，在-50℃条件下干燥，得到绿僵菌绿色色素a。绿僵菌绿色色素a的纯度大于98％。

23、步骤八结构鉴定

24、通过高分辨液质联用分析获得化合物分子式，通过液体核磁共振获得化合物的化学结构。由于使用液体核磁进行化合物的结构鉴定时，需要保证化合物的纯度在98％以上，本发明中绿僵菌绿色色素a的纯度能够达到要求。

25、进一步的，步骤一中，平板培养基为pda培养基或sday培养基，培养温度为20-35℃，培养5-10天，选则的绿僵菌可为蝗绿僵菌(metarhiziumacridum)、黄绿绿僵菌(metarhiziumflavoviride)、罗伯茨绿僵菌(metarhiziumrobertsii)中的任意一种。

26、进一步的，步骤二中，摇瓶培养的条件为：摇床转速50～200rpm，温度20～35℃，培养3～10天。大米培养基经温水浸泡10～60分钟，使用120℃灭菌20分钟。

27、进一步的，步骤三中，酶解前处理试剂为甲醇或乙醇与乙酸乙酯按体积比1:0.2-0.6混合而成。酶解前处理试剂主要用于去除孢子脂溶性成分，利于酶解液与孢子的充分混合，提高酶解效率。

28、进一步的，步骤四中，纤维素酶溶液、蜗牛酶溶液、几丁质酶溶液的质量浓度均为1％；纤维素酶溶液：蜗牛酶溶液：几丁质酶溶液中的溶剂均为柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液。该步骤先分别配置1％的酶溶液，再混合后使用。

29、当然，上述溶剂可以更换为tris-hcl缓冲液、磷酸盐缓冲液，只要能够保证酶解期间ph稳定，以保证酶的效果即可。

30、柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液的配置方法为：分别配置0.1m的柠檬酸及柠檬酸钠溶液，取12-15ml0.1m的柠檬酸溶液与180-190ml0.1m的柠檬酸钠溶液混合，得到ph为6-7的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液。

31、酶解处理的条件为：反应在25-35℃、75-85rpm的摇床中反应3-5小时。反应完成后7500-9000rpm离心4-7分钟。

32、进一步的，步骤五中，由于苯酚在室温下为固体，提取时需在温度为65-80℃的水浴锅中进行。

33、进一步的，步骤六中，sephadexlh-20分离使用的洗脱液为苯酚含量5％-20％的甲醇溶液。

34、进一步的，步骤七中，流动相a和流动b中加入0.1％-0.5％的甲酸。

35、进一步的，步骤八中，液质联用仪器条件：氮气温度325℃，氮气流速12l/min，雾化气压35psi；毛细管电压：阳离子4000v；碎裂电压：阳离子215v，分离器电压60v；质量采集范围：阴阳离子模式均为50-1000da。液体核磁试验使用氘代二甲基亚砜作为溶剂进行分析。

36、高分辨液质联用分析结果显示：绿僵菌绿色色素a在阳离子模式下其质荷比(m/z)为565.0875(c18h13n8o14)，1129.1511的峰为[2m+h]+(c36h25n16o28)的质荷比；阴离子模式下质荷比(m/z)为563.0705(c18h11n8o14)，1127.1350的峰为[2m-h]-(c36h23n16o28)的质荷比。最终确定绿僵菌绿色色素a的分子式c18h12n8o14不饱和度为17。其紫外吸收峰为266nm、340nm。核磁共振分析显示，绿僵菌绿色色素a含有对称结构，核磁数据见下表：

37、表1核磁数据

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39、

40、综合液质联用分析和核磁共振分析得出：分离纯化出的绿僵菌绿色色素a的结构为：

41、

42、本发明中，绿僵菌绿色色素a的纯度通过液质联用仪进行检测，由目的化合物在离子流图中的峰面积占比得出(目的化合物峰面积占样品总峰面积的比值)。

43、本发明的绿僵菌绿色色素a及其提取方法相对于现有技术具有以下有益效果：

44、1、本发明采用酶解+苯酚提取的方法获得了绿僵菌绿色色素a的纯品，绿僵菌绿色色素a的纯度大于98％，并通过液质联用分析的方式得出绿僵菌绿色色素a的结构，解决了绿僵菌绿色色素a分子结构未被解析的难题。

45、2、在酶解+苯酚提取的方法基础上，确定细胞壁酶解液中纤维素酶溶液、蜗牛酶溶液、几丁质酶溶液的最优体积比范围，保证色素提取率，同时控制成本。另外确定了苯酚的最佳添加量范围，保证色素的提取率，提高绿僵菌绿色色素a的提取效率。

46、3、绿僵菌绿色色素a分子结构的确定，为其合成基因的确定、代谢通路的鉴定及商品化应用奠定基础。同时，绿僵菌绿色色素a为天然色素，具有良好的安全性，稳定性远强于植物叶绿素，该色素仅在特定溶剂中溶解，因此着色后有良好的稳固性，具有广泛的应用前景。

47、4、本发明提取的绿僵菌绿色色素a的原料菌株为绿僵菌，是常见的昆虫寄生菌，并且已有商业化绿僵菌孢子制品，生产成本较低，工艺流程相对简单，可大型工业化生产。