一种单核细胞增生李斯特氏菌强组成型启动子及其应用

本发明涉及生物工程，具体涉及一种单核细胞增生李斯特氏菌强组成型启动子及其应用。

背景技术：

1、单核细胞增生李斯特氏菌(listeria monocytogenes，lm)是一种革兰氏阳性的食源性致病菌。其大小约为1.0-2.0μm×0.5μm，兼性厌氧且不能够产生芽孢。李斯特氏菌的生长温度范围较为广泛，在-0.4至50℃间均可生长，另外，由于该菌能够产生生物被膜，因此可以耐受一些高盐或是低水分活度的环境。lm广泛存在于自然界中，植物、土壤、地表水样品、或是畜禽体内及野生动物体内都可能存在lm，并且其很容易通过生产和加工过程污染食品。当进食这些被lm污染的食品后，lm可穿透人体的三大屏障：肠道屏障、血脑屏障和胎盘屏障，导致肠胃炎、脑膜炎、败血症、流产等症状，被认为是最严重的食源性疾病。国内外对于lm的研究大多集中在环境耐受性、流行性、食品中的生长动力学等方面，针对分子生物学方面的研究，尤其是启动子的开发相对较少。启动子是含有rna聚合酶特异性识别、结合和转录起始所需的保守序列的基因表达元件，多数启动子是位于结构基因转录起始点的上游，是基因表达和转录的“开关”。启动子按照是否需要诱导可分为分组成型启动子和诱导型启动子两大类，araa，t7启动子等是常用的诱导型强启动子，需要在昂贵的诱导剂的使用才能启动基因表达，相较于诱导性启动子，组成型启动子能够稳定持续表达成为多数蛋白表达的优先选择。目前合成生物学的兴起对于启动子元件的需求不断扩大，找到一个组成型的强启动子具有重要的应用价值。

技术实现思路

1、为解决上述技术问题，本发明在单核细胞增生李斯特氏菌中，以报告基因对其启动子进行筛选和应用评价，获得了一组组成型的强启动子。

2、本发明的第一个目的是提供一种单核细胞增生李斯特氏菌强组成型启动子，所述强组成型启动子为seq id no.1-4所示的核苷酸序列之一。

3、本发明的第二个目的是提供包含上述强组成型启动子的表达载体。

4、进一步地，所述表达载体为核酸载体、质粒或病毒载体。

5、进一步地，所述表达载体为适用于单核细胞增生李斯特氏菌或大肠杆菌组成型表达的载体。

6、进一步地，所述表达载体的出发载体可为任何适用于宿主细胞的载体，包括但不限于pet系列载体、pimk2载体等。

7、本发明的第三个目的是提供一种重组核酸构建体，包含上述强组成型启动子以及连接在启动子下游的一核酸分子。

8、进一步地，核酸分子可为基因，基因可编码一蛋白。

9、本发明的第四个目的是提供一种基因表达单元，包含上述重组核酸构建体和终止子。

10、本发明的第五个目的是提供包含上述强组成型启动子的重组细胞。

11、进一步地，所述重组细胞的宿主细胞可来源于动物、植物或微生物。

12、进一步地，所述重组细胞的宿主细胞为大肠杆菌或单核细胞增生李斯特氏菌。

13、本发明的第六个目的是提供包含上述强组成型启动子的表达系统。

14、本发明的第七个目的是提供上述强组成型启动子在对细胞进行遗传改造中的应用。如应用于基因工程改造或合成生物学领域，当然不限于其他方面如生物传感等领域的应用。

15、进一步地，所述的应用是采用上述启动子启动组成型基因的表达。

16、本发明的第八个目的是提供一种提高基因组成型表达的方法，采用上述启动子对基因进行组成型表达。

17、进一步地，所述基因为大肠杆菌或李斯特菌中含有的基因。

18、本发明的有益效果：

19、本发明以单核细胞增生李斯特氏菌为研究对象，经过筛选和改造得到一系列不同长度的组成型启动子，随后以绿色荧光蛋白为报告基因，通过不同启动子驱动其表达，比较荧光强度差异，最终获得了具有较高活性的强组成型启动子。该启动子在大肠杆菌中表达gfp的活性是以iptg诱导表达的2-4倍。该启动子也被证实能够在单核细胞增生李斯特氏菌中高效表达蛋白。因此本发明的启动子具有良好的应用前景，丰富了合成生物学元件，同时也为不同菌种尤其是李斯特菌在基因工程改造及外源基因表达上奠定了基础。

技术特征：

1.一种单核细胞增生李斯特氏菌强组成型启动子，其特征在于，所述强组成型启动子为seq id no.1-4所示的核苷酸序列之一。

2.包含权利要求1所述强组成型启动子的表达载体。

3.一种重组核酸构建体，其特征在于，包含权利要求1所述强组成型启动子，以及连接在启动子下游的一核酸分子。

4.一种基因表达单元，其特征在于，包含权利要求3所述重组核酸构建体和终止子。

5.包含权利要求1所述强组成型启动子的重组细胞。

6.根据权利要求5所述的重组细胞，其特征在于，宿主细胞来源于动物、植物或微生物。

7.根据权利要求6所述的重组细胞，其特征在于，宿主细胞为大肠杆菌或单核细胞增生李斯特氏菌。

8.包含权利要求1所述强组成型启动子的表达系统。

9.权利要求1所述强组成型启动子在对细胞进行遗传改造中的应用。

10.一种提高基因组成型表达的方法，其特征在于，采用权利要求1所述强组成型启动子对基因进行组成型表达。

技术总结
本发明公开了一种单核细胞增生李斯特氏菌强组成型启动子及其应用，尤其是设计了一种具有高转录活性的组成型启动子。具体地，以单核细胞增生李斯特氏菌为研究对象，经过筛选和改造得到一系列不同长度的组成型启动子，随后以绿色荧光蛋白为报告基因，通过不同长度启动子驱动其表达，比较荧光强度差异，最终获得了具有较高活性的强组成型启动子。该启动子在大肠杆菌中表达GFP的活性是以IPTG诱导表达的2‑4倍。该启动子也被证实能够在单核细胞增生李斯特氏菌中高效表达蛋白。本发明的启动子具有良好的应用前景，丰富了合成生物学元件，同时也为不同菌种尤其是李斯特菌在基因工程改造及外源基因表达上奠定了基础。

技术研发人员：陈晶瑜,李文倩
受保护的技术使用者：中国农业大学
技术研发日：
技术公布日：2024/3/17