DNA甲基化转化方法、甲基化酶转化试剂盒及其使用方法与流程

本发明涉及dna甲基化领域，具体涉及一种dna甲基化转化方法、甲基化酶转化试剂盒及其使用方法。

背景技术：

1、dna甲基化是dna化学修饰的一种形式，能够在不改变dna序列的前提下，改变遗传表现，是最重要的表观遗传调控方式之一。

2、简单地说，dna甲基化是指在dna甲基化转移酶(dnmt)的作用下，在基因组cpg二核苷酸的胞嘧啶5号碳位共价键结合一个甲基基团。大量研究表明，dna甲基化能引起染色质结构、dna构象、dna稳定性及dna与蛋白质相互作用方式的改变，从而控制基因表达。dna甲基化修饰在维持正常细胞的功能、雌性个体x染色体失活、寄生dna序列的抑制、基因组结构稳定、遗传印记、胚胎发育、及肿瘤和疾病的发生、发展紧密相关，具有至关重要的作用，是目前及未来很长一段时间的研究热点之一。

3、目前，关于dna甲基化的分析方法主要有：甲基化敏感性限制性内切酶-pcr/southern法、重亚硫酸盐测序法、甲基化特异性的pcr、甲基化荧光法、焦磷酸测序、甲基化dna免疫共沉淀、以及结合重亚硫酸盐的限制性内切酶法等。

4、其中全基因组重亚硫酸盐甲基化测序(wgbs)可以在全基因组范围内精确的检测所有单个胞嘧啶碱基(c碱基)的甲基化水平，长期以来一直是甲基化图谱分析的金标准。其原理主要是，用亚硫酸氢盐处理dna可将胞嘧啶残基(c)转化为尿嘧啶(u)，但5-甲基胞嘧啶残基(简称：5-mc)对其有抗性，并不会发生转变。其中，5-羟甲基胞嘧啶简称：5-hmc。

5、因此，亚硫酸氢盐处理引入了依赖于单个c残基甲基化状态的dna序列的特定变化，从而产生有关dna片段甲基化状态的单核苷酸分辨率信息。

6、然而，重亚硫酸氢缓冲液转化时会给样本dna带来较大损伤，高gc区域未发生甲基化修饰的位点容易发生断裂，发生甲基化修饰的位点容易形成发夹结构，导致dna片段转化不完，从而导致序列多样性较差，目标富集偏差以及较高的测序误差；

7、同时，柱纯化亚硫酸氢盐转化法流程繁琐、操作复杂，对实验人员的要求更高。

8、上述缺点，限制了全基因组重亚硫酸盐甲基化测序在低起始量样本单细胞、ffprdna、cfdna、古dna等分析中的应用。

技术实现思路

1、本发明的目的是为了解决现有技术中的不足，提供一种转化效率高，有效降低dna的损伤，从而降低核酸样品中dna的投入量要求的dna甲基化转化方法、甲基化酶转化试剂盒及其使用方法。

2、为解决上述技术问题，本发明采用的技术方法是：本发明公开了一种一种dna甲基化转化方法，包括如下步骤：

3、s1.对样本dna，使用人甲基胞嘧啶双加氧酶2进行酶反应，实现由5-甲基胞嘧啶到5-羟甲基胞嘧啶到5-甲酰胞嘧啶最后到5-羧基胞嘧啶的催化过程；

4、s2.使用t4噬菌体β-葡糖基转移酶完整地将尿苷二磷酸葡萄糖的葡萄糖基团转移至双链dna中的5-羟甲基胞嘧啶基团上，形成β-葡糖基-5-羟甲基胞嘧啶；

5、s3.进行脱氨反应，使用胞嘧啶脱氨酶，在不影响5-羧基胞嘧啶和β-葡糖基-5-羟甲基胞嘧啶的情况下，将单链dna中的胞嘧啶去氨基变为尿嘧啶，实现将原始序列中的胞嘧啶与5-甲基胞嘧啶、5-羟甲基胞嘧啶区分开，进而实现单碱基分辨率识别dna甲基化位点。

6、进一步的，将脱去氨基的单链dna进行聚合酶链式反应扩增，修饰的5-羧基胞嘧啶和β-葡糖基-5-羟甲基胞嘧啶依然为胞嘧啶，而尿嘧啶转化为胸腺嘧啶，从而识别出甲基化位点c→c与非甲基化位点c→t。

7、本发明还公开了一种甲基化酶转化试剂盒，包括第一氧化反应液、为所述第一氧化反应液提供离子条件的第二氧化反应液、终止反应液、用于将dna双链变为单链的变性反应液、第一脱氨反应液、为所述第一脱氨反应液提供离子条件的第二脱氨反应液、纯化反应液和无核酶水；

8、所述第一氧化反应液包括无核酶水、人甲基胞嘧啶双加氧酶2、t4噬菌体β-葡糖基转移酶、10mm三羟甲基氨基甲烷、20mm磷酸钾、200mm氯化钠、0.25mm二硫苏糖醇、0.1mm乙二胺四乙酸、50％甘油；

9、所述第一脱氨反应液包括胞嘧啶脱氨酶、20mm三羟甲基氨基甲烷盐酸盐、50mm氯化钠、1mm二硫苏糖醇、0.1mm乙二胺四乙酸、50％甘油、无核酶水；

10、进一步的，所述第二氧化反应液包括无核酶水、100mm三羟甲基氨基甲烷盐酸盐、500mm氯化钠、10mmα-酮戊二酸；10mm l-抗坏血酸、10mm三磷酸腺苷、5mm二硫苏糖醇、0.1mm尿苷二磷酸葡萄糖和20mm亚铁盐化合物；

11、所述第二脱氨反应液包括50mm醋酸钾，20mm三羟甲基氨基甲烷醋酸盐，10mm乙酸镁，1mm二硫苏糖醇，1％bsa、无核酶水。

12、进一步的，所述终止反应液包括200mg/ml蛋白酶k、20mm三羟甲基氨基甲烷盐酸盐、1mm氯化钙、50％甘油、无核酶水；

13、所述变性反应液包括无核酶水、甲酰胺；

14、所述结合缓冲液包括30％peg 8000、1m nacl和0.2m tris-hcl，ph 8.0、无核酶水。

15、进一步的，所述纯化反应液包括磁珠和磁珠结合缓冲液，所述磁珠选用1μmmagbeads50mg/ml。

16、本发明还公开了一种甲基化酶转化试剂盒使用方法，基于上述甲基化酶转化试剂盒，还包括如下步骤，

17、sa1.含dna分子的样品溶液与第一氧化反应液、第二氧化反应液混匀，37℃孵育1小时进行氧化反应；

18、sa2.待氧化反应结束后，在反应体系中加入终止反应液，50℃孵育15min以消化第一氧化反应液中剩余的酶来终止反应；

19、sa3.步骤中sa2完成后，加入变性反应液，将样品在85℃下变性10分钟，使dna分子从双链结构变为单链结构，然后立即转移到在冰上；再加入预冷配制好的第一脱氨反应液和第二脱氨反应液，37℃孵育3小时进行脱氨反应；

20、sa4.纯化回收dna。

21、进一步的，在所述步骤sa2中，还包括在终止反应后，纯化回收dna。

22、进一步的，在所述步骤sa1中，含dna分子的样品溶液与第一氧化反应液、第二氧化反应液的比例为：15:2:8。

23、进一步的，在所述步骤sa3中，含dna分子的样品溶液、第一脱氨反应液、第二脱氨反应液与无核酶水的比例为20:1:11:68。

24、有益效果：

25、1、本发明方案的酶法转化与亚硫酸氢盐转化的结果相似，因此并不会对下游应用产生影响，也可采用原先的数据分析工具。但与wgbs相比，本发明可以在较少的pcr循环内获得更高的文库产量,包含更少的测序重复，产生更多可用的序列，增加了基因组的有效覆盖度，gc偏好性更标准，数据质量更高。

26、2、本发明中的甲基化酶转化试剂盒，能够特异性地识别并转换5-mc和5hmc，后期衔接甲基化建库试剂盒，可完成甲基化测序文库的构建，以单碱基分辨率有效识别dna甲基化。相比重亚硫酸盐转化法而言，转化效率更高、反应条件更加温和，有效降低dna的损伤，从而降低核酸样品中dna的投入量要求，dna投入量可低至1ng甚至更低，更加适于包括单细胞、cfdna、ffpe dna、古dna等在内的微量样本甲基化研究。

27、3、本发明提供的试剂盒采用磁珠纯化方案，相比之前的柱纯化方案而言，纯化效率更高，对实验室设备的要求更低，并且有望实现自动化应用方案。