一种包含TEV蛋白酶的融合蛋白、制备方法及其应用与流程

本发明涉及生物医药领域，尤其涉及一种包含tev蛋白酶的融合蛋白、制备方法及其在制备蛋白质聚集体中的应用。

背景技术：

1、在大肠杆菌表达重组蛋白或多肽以可溶性或包涵体形式在细胞内存在，小于100个氨基酸的多肽在重组表达过程中易被大肠杆菌细胞内蛋白酶降解，在表达多肽n端加上促包涵体形成融合标签（inclusion body ib inducer）可以促进表达，促进所表达的高纯度融合蛋白均以不溶性的包涵体形式存在，生成蛋白质聚集体可有效降低宿主细胞中的蛋白酶对融合蛋白的降解作用，有利于目的多肽的纯化。一般ib inducer多为疏水氨基酸形成βsheets或α螺旋短肽形成α螺旋束（alpha helix bundle）以促进多肽聚集体形成。

2、tev蛋白酶(tev protease)是来源于烟草蚀纹病毒(tev)的nla蛋白酶中27kda的活性结构域，具有很强的位点特异性，其序列专一性远比凝血酶、因子xa、肠激酶等蛋白酶高。野生型tev酶在表达和溶解性等方面存在一定的缺陷。野生型tev蛋白酶可溶性极低，在大肠杆菌中表达如果没有促溶标签或分子伴侣（chaperone）共表达，极易在胞内聚集形成包涵体。tev蛋白酶作为一种工具酶已在蛋白质研究和生物制药生产中得到了广泛的应用，多用于重组蛋白表达纯化广泛使用，用于切割去除融合蛋白中的促表达或促溶标签。

3、由于tev蛋白酶多使用其切割特性，目前尚无将其作为促表达标签用于促进目的蛋白表达的研究。

技术实现思路

1、为克服现有技术中存在的不足，本发明提供了一种tev蛋白酶作为促表达标签的应用。具体的，所述的tev蛋白酶与目的蛋白相连，促进蛋白质聚集体的形成，进而促进目的蛋白的表达。

2、本发明的第一方面，提供了一种融合蛋白，所述的融合蛋白包含tev蛋白酶片段和目的蛋白，所述的tev蛋白酶片段为seq id no：1-5任一所示的氨基酸序列。

3、更优选的，所述的tev蛋白酶片段连接在目的蛋白的n端或c端，所述tev蛋白酶片段与目的蛋白直接或者间接连接。

4、本发明的目的蛋白包括蛋白质，也可以包括多肽，例如，短肽等氨基酸残基数量小于等于100的多肽。

5、优选的，所述的tev蛋白酶片段和目的蛋白通过接头序列连接。

6、优选的，所述的接头序列包括酶切位点，用于分离目的蛋白。例如牛肠激酶酶切序列、sumo蛋白酶酶切序列、免疫球蛋白降解酶酶切序列或3c蛋白酶酶切序列。

7、更优选的，所述的接头序列的氨基酸序列如seq id no：11所示。

8、优选的，所述的tev蛋白酶片段促进蛋白质聚集体的形成，进而促进目的蛋白的表达，所述的tev蛋白酶片段不行使其酶切活性。

9、优选的，所述的编码tev蛋白酶片段的核苷酸序列包括seq id no：6-10任一所示的核苷酸序列、其互补或简并序列，或与seq id no：6-10任一所示的核苷酸序列具有80%以上同源性的核苷酸序列，并编码具有相同功能的tev蛋白酶片段。

10、优选的，所述的目的蛋白包括β折叠或α螺旋结构。

11、优选的，所述目的蛋白包括但不限于il-7、glp1、glp2、pth等，更优选的，所述的目的蛋白包括seq id no：13、15-17任一所示的序列。

12、本发明的第二方面，提供了一种蛋白质聚集体，所述蛋白质聚集体包括上述的融合蛋白。

13、优选的，所述蛋白质聚集体不溶于水。

14、本发明的第三方面，提供了一种生物材料，所述生物材料包括：

15、（a）一种核酸，所述核酸包含编码上述融合蛋白的核酸分子；

16、（b）一种载体，所述载体包含（a）所述的核酸；

17、（c）一种宿主菌，所述宿主菌包含（a）所述的核酸或（b）所述的载体。

18、优选的， 所述的生物材料表达目的蛋白。

19、在一个具体实施方式中，所述目的蛋白包括但不限于il-7、glp1、glp2、pth等，更优选的，所述的目的蛋白包括seq id no：13、15-17任一所示的序列。

20、本发明的第四方面，提供了上述生物材料在制备融合蛋白或蛋白质聚集体中的应用。

21、本发明的第五方面，提供了一种制备上述融合蛋白的方法，所述的方法包括：

22、1）合成编码所述融合蛋白的基因，构建表达载体，并将表达载体转入宿主菌中；

23、2）培养宿主菌，表达融合蛋白。

24、本发明的第六方面，提供了一种制备上述蛋白质聚集体的方法，所述的方法包括：

25、1）合成编码所述融合蛋白的基因，构建表达载体，并将表达载体转入宿主菌中；

26、2）培养宿主菌，表达融合蛋白；

27、3）裂解表达融合蛋白的宿主菌，获得蛋白质聚集体，将所述蛋白质聚集体与所述宿主菌的水溶性内容物分离。

28、进一步，在本发明第五和/或第六方面，

29、优选的，所述的步骤2）的方法包括将宿主菌过夜培养后，继续转接到培养基中并加入诱导剂过夜培养。

30、优选的，所述的步骤2）的方法中菌液：培养基的转接比例为1：（50-200），例如1：（50、70、100、120、150、170、200）。更优选的，所述比例为质量比。

31、优选的，所述的步骤2）的方法中培养条件为24-37℃（例如24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37℃）、150-250rpm（例如150、180、200、210、220、230、240、250rpm）。

32、优选的，所述的菌液培养至od600为1.0-2.0（例如1.0、1.3、1.5、1.7、1.9、2.0）后加入诱导剂。

33、优选的，所述的诱导剂包括但不限于iptg、ahl、四环素或阿拉伯糖。

34、优选的，所述的诱导剂浓度为0.1-1.0 mm（例如0.1、0.3、0.5、0.7、0.9、1.0 mm）。

35、在一个具体实施方式中，所述的步骤2）包括将宿主菌在lb培养基中培养过夜，按照菌液：培养基的1:100比例加入tb培养基中，220rpm 37℃培养至od600为2.0左右，加入iptg至终浓度为1mm,诱导重组蛋白表达, 220rpm 37℃诱导过夜。

36、优选的，所述的步骤3）包括离心收集菌体，裂解菌体，离心分离蛋白质聚集体。

37、优选的，所述的裂解菌体方式包括离心、超声、搅拌或共均质匀浆裂菌。

38、优选的，所述宿主菌不包含tev蛋白酶的底物。

39、本发明的第七方面，提供了一种tev蛋白酶在促进目的蛋白表达中的应用，将编码所述的tev蛋白酶片段的核苷酸序列与编码目的蛋白的核苷酸序列连接，转入宿主菌，在宿主菌中表达包含tev蛋白酶片段和目的蛋白的融合蛋白，所述的tev蛋白酶片段为seq idno：1-5任一所示的氨基酸序列。

40、优选的，所述的目的蛋白包括β折叠或α螺旋结构。

41、优选的，所述的融合蛋白形成蛋白质聚集体。

42、优选的，所述蛋白质聚集体不溶于水。

43、优选的，所述的融合蛋白如第一方面所述，或者获得如第二方面所述的蛋白质聚集体。

44、本发明术语“蛋白质聚集体”是一种包含包涵体的聚集体，蛋白质聚集指错折叠的蛋白质分子间通过疏水作用形成非晶态聚合物的过程。而包涵体形成是比较复杂的，与胞质内蛋白质生成速率有关，新生成的多肽浓度较高，无充足的时间进行折叠，从而形成非结晶、无定形的蛋白质的聚集体。包涵体内的蛋白是非折叠状态的聚集体，不具有生物学活性。

45、本发明术语“包括”或“包含”是开放式的描述，含有所描述的指定成分或步骤，以及不会实质上影响的其他指定成分或步骤。

46、本发明的有益效果：

47、本技术利用tev蛋白酶极为疏水在大肠杆菌中易形成包涵体的特性，将tev蛋白酶序列拆分成不同片段，使用片段中疏水的β链作为促包涵体形成标签，促进目的蛋白的表达，提高目的蛋白的表达量，形成包涵体。可以使原本不易表达的多肽在添加促表达标签后可以进行表达。本技术生产工艺利于目的蛋白下游的分离纯化，有利于药用多肽，尤其是小分子药用多肽的大规模工业化生产。