用于烟粉虱防治的RNAi靶标基因及其应用

本发明涉及生物，尤其涉及一种用于烟粉虱防治的rnai靶标基因及其应用。

背景技术：

1、烟粉虱bemisia tabaci，属半翅目hemiptera，粉虱科aleyrodidae，是一种广泛分布于中国、美国、印度、马来西亚、日本等国的世界性农业害虫。作为多食性害虫，烟粉虱的寄主范围十分广泛，寄主植物多达420余种，包括葫芦科、十字花科、豆科、茄科等。烟粉虱可直接刺吸寄主植物的汁液，导致植物果实发育不均匀，叶片焦黄、萎蔫和植株矮小。其次，烟粉虱会分泌蜜露，对叶片和果实进行侵害，导致煤污病。更重要的是，烟粉虱能作为载体传播超过200种植物病毒，对植物造成严重危害。据相关数据统计，烟粉虱每年造成的经济损失达数十亿美元。如果不加以控制，其后果将愈发严重。目前，烟粉虱的防治多采用化学药剂，但常年用药，导致烟粉虱抗药性的产生。且化学防治带来的农药残留问题、食品安全问题及环境污染问题也日益严重。因此，亟需开发一种绿色有效且环境安全的防治方法。

2、rna干扰(rna interference，rnai)是一种广泛存在于真核生物的转录后基因沉默现象，其原理是dsrna(double-stranded rna)可引起生物体内同源序列mrna的特异性降解。rnai现象最早是在研究秀丽隐杆线虫caenorhabditis elegans反义rna(antisenserna)的过程中被发现，其后陆续在真菌、果蝇、拟南芥、昆虫、小鼠等多种真核生物中发现。它在真核生物中参与抵御病毒感染、抑制转座子活性、调控基因的表达，且在机体的发育调控及生理代谢方面具有重要的生物学意义。rnai的快速发展，为深入了解生物的基因功能提供了可行且便利的技术手段，且为开发对环境友好的害虫治理方法奠定了基础。由于rnai技术可以靶向干扰害虫基因，对非靶标昆虫影响小，在害虫绿色防治中具有广阔的应用前景。

3、昆虫生殖细胞的分化受snf、ovo、otu等性别决定基因的调控。ovo基因最早在果蝇中被发现，它能调控果蝇生殖细胞的形成和发育。在雌性果蝇中，ovo的强突变会导致雌性卵巢无法正常形成生殖细胞，而弱突变则导致卵巢畸形，产生肿瘤。目前，ovo的同源基因在人、小鼠、涡虫、线虫、斑马鱼、家蚕等生物中被鉴定出来，且它们在控制生殖细胞发育方面表现出极强的功能保守性。因此，ovo具有成为害虫防治靶标基因的潜力。然则，国内外尚没有关于烟粉虱ovo基因的相关研究报道。

技术实现思路

1、本发明所要解决的技术问题在于，提供一种用于烟粉虱防治的rnai靶标基因，其可有效抑制雌性烟粉虱的繁殖力。

2、本发明还要解决的技术问题在于，提供一种生物制剂，其可有效抑制雌性烟粉虱的繁殖力。

3、本发明还要解决的技术问题在于，提供上述的rnai靶标基因在防治烟粉虱中的应用。

4、本发明还要解决的技术问题在于，提供一种烟粉虱的防治方法，其易于操作，效果良好。

5、本发明还要解决的技术问题在于，提供一种用于烟粉虱防治的rnai靶标基因的制备方法。

6、本发明还要解决的技术问题在于，提供一种引物对。

7、为了解决上述问题，本发明公开了一种用于烟粉虱防治的rnai靶标基因，其正义链序列如seq id no.2所示，反义链序列如seq id no.3所示。该rnai靶标基因在烟粉虱生殖发育过程中起着非常重要的作用，沉默该基因，对烟粉虱个体的生殖发育造成严重的影响。

8、需要说明的是，本发明中rnai靶标基因并不限于seq id no.2和seq id no.3所示的序列，其还可以是在seq id no.2、seq id no.3所示的序列上经过一个或多个氨基酸残基的替换和/或删除得到的，具有与seq id no.2、seq id no.3所示序列相同生物活性的衍生序列。

9、相应的，本发明还公开了一种用于防治烟粉虱的生物制剂，其包括上述的rnai靶标基因，该生物制剂可通过注射、饲喂或体壁渗透进入烟粉虱体内。

10、作为上述技术方案的改进，所述生物制剂为饲喂式制剂、注射剂或喷施性rna农药。

11、相应的，本发明还公开了上述的rnai靶标基因在防治烟粉虱中的应用，所述rnai靶标基因用于抑制雌性烟粉虱的繁殖力。

12、相应的，本发明还公开了一种用于烟粉虱防治的rnai靶标基因的制备方法，其包括：

13、(1)以烟粉虱cdna为模板，以序列如seq id no.6所示的上游引物，序列如seq idno.8所示的下游引物进行扩增，得到用于合成dsrna的模板；

14、(2)以所述模板合成dsrna，消除dna和单链rna后纯化，即得到用于烟粉虱防治的rnai靶标基因。

15、作为上述技术方案的改进，步骤(1)中，扩增反应的反应体系包括：es taq mix12.5μl，浓度为10μmol/l的上游引物0.5μl，浓度为10μmol/l的下游引物0.5μl，烟粉虱cdna1μl，无菌蒸馏水10.5μl；

16、反应条件为：95℃预变性10min；95℃变性30s，57℃退火30s，72℃延伸60s，共35个循环，最后在72℃延伸10min。

17、作为上述技术方案的改进，步骤(2)中，合成dsrna的反应体系包括：express t7 2×buffer 10μl，用于合成dsrna的模板1μg，enzyme mix,t7 express 2μl，nuclease-freewater补齐至20μl；

18、合成dsrna的条件为：37℃温育0.5～6h，70℃反应10min，在20～30℃放置20min。

19、相应的，本发明还公开了一种引物对，其包括序列如seq id no.6所示的上游引物和序列如seq id no.8所示的下游引物。

20、本发明利用生物信息学技术，分析了烟粉虱基因组，注释并克隆了烟粉虱ovo基因，获得了ovo基因的全长序列，然后按下面步骤进行实验：1)提取烟粉虱总rna，反转录得到cdna；2)设计带有t7序列的特异性引物；3)通过pcr技术扩增目的基因干扰片段，得到带有t7序列和目的基因片段的pcr产物；4)回收干扰片段，并进行测序验证；5)利用dsrna合成试剂盒合成目的基因片段dsrna；6)进行rnai实验，把靶标基因dsrna传递到烟粉虱体内；7)统计死亡率，计算干扰效率，观察表型。

21、实施本发明，具有如下有益效果：

22、本发明提供了一种用于烟粉虱防治的rnai靶标基因，通过饲喂法将dsrna传递到烟粉虱体内，收集干扰后的烟粉虱雌成虫进行繁殖力的检测。结果显示，干扰后，雌性烟粉虱卵巢内的成熟卵子数减少，产卵量显著下降，后代孵化率及体长显著降低。说明干扰ovo基因，雌性烟粉虱的繁殖力锐减。本发明为将来烟粉虱rnai介导的害虫防治策略提供了较好的候选基因，同时也为将来的田间应用试验提供了理论依据。

技术特征：

1.一种用于烟粉虱防治的rnai靶标基因，其特征在于，其正义链序列如seq id no.2所示，反义链序列如seq id no.3所示。

2.一种用于防治烟粉虱的生物制剂，其特征在于，包括如权利要求1所述的rnai靶标基因。

3.如权利要求1所述的生物制剂，其特征在于，所述生物制剂通过注射、饲喂或体壁渗透进入烟粉虱体内。

4.如权利要求2或3所述的生物制剂，其特征在于，所述生物制剂为饲喂抑制剂、注射剂或喷施性rna农药。

5.如权利要求1所述的rnai靶标基因在防治烟粉虱中的应用，其特征在于，所述rnai靶标基因用于抑制雌性烟粉虱的繁殖力。

6.一种防治烟粉虱的方法，其特征在于，将如权利要求1所述的rnai靶标基因导入烟粉虱。

7.一种用于烟粉虱防治的rnai靶标基因的制备方法，其特征在于，包括：

8.如权利要求7所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，扩增反应的反应体系包括：es taq mix 12.5μl，浓度为10μmol/l的上游引物0.5μl，浓度为10μmol/l的下游引物0.5μl，烟粉虱cdna 1μl，无菌蒸馏水10.5μl；

9.如权利要求7所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，合成dsrna的反应体系包括：express t7 2×buffer 10μl，用于合成dsrna的模板1μg，enzyme mix,t7 express 2μl，nuclease-free water补齐至20μl；

10.引物对，其特征在于，包括序列如seq id no.6所示的上游引物和序列如seq idno.8所示的下游引物。

技术总结
本发明提供了一种用于烟粉虱防治的RNAi靶标基因，通过饲喂法将dsRNA传递到烟粉虱体内，收集干扰后的烟粉虱雌成虫进行繁殖力的检测。结果显示，干扰后，雌性烟粉虱卵巢内的成熟卵子数减少，产卵量显著下降，后代孵化率及体长显著降低。说明干扰ovo基因，雌性烟粉虱的繁殖力锐减。本发明为将来烟粉虱RNAi介导的害虫防治策略提供了较好的候选基因，同时也为将来的田间应用试验提供了理论依据。

技术研发人员：刘雅婷,方草,陈宗泽,陈文胜,谢文,雷妍圆
受保护的技术使用者：佛山科学技术学院
技术研发日：
技术公布日：2024/4/17