一种PCR检测试剂及方法和应用

本发明涉及生物科学，尤其涉及一种pcr检测试剂及方法和应用。

背景技术：

1、组织聚合酶链反应（polymerase chain reaction，pcr）是一种常用的分子生物学技术，近年来用于检测和放大组织样本中的特定dna或rna序列，方法操作方便、实验室污染风险低。在中枢神经系统感染性疾病的临床诊断中，pcr被广泛用于检测脑脊液等样本的病原学检测。但是对于颅内占位病变（bml）来说，pcr目前尚未用于常规检测，尤其是hiv感染相关的诊断。

2、艾滋病（acquired immunodeficiency syndrome，简称aids）是由人类免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus，简称hiv）引起的一种严重的免疫系统疾病。艾滋病患者由于免疫系统受损，容易发生感染性病变，在中枢神经系统（central nervous system，cns）中可能形成多种颅内占位病变（brain mass lesions，bml）；感染炎症刺激或占位效应导致患者颅内压力增加，可能造成头痛、癫痫发作、意识障碍或昏迷等，容易造成较高的病死率和不良预后，早期诊断和及时治疗对于改善患者颅内感染性占位病变的预后至关重要。常规的影像学，如电子计算机断层扫描（ct）、核磁共振成像（mri）和实验室检查（如血液及脑脊液的生化、病原检测）对于识别病变位置、评估周围组织受累和炎症反应程度具有辅助意义，立体定向颅内病变活检病理诊断为进一步明确病变的性质和病因提供了支持。但是根据以往临床经验，aids相关的颅内占位病变病原学诊断较为困难，这也导致临床诊疗过程中无法及时、准确地针对相关病原实施针对性治疗。

3、现有研究成果证明pcr技术可显著提高hiv感染者中枢神经系统（cns）感染性疾病的诊断效率，初步得出组织标本的pcr检测技术对于此类疾病诊断有着较高的特异性和灵敏性。 pcr 技术可用于多种病原微生物的同时检测或鉴定、某些遗传病及癌基因的分型鉴定等，具有高效性、系统性、经济简便性的特点。但是就hiv感染者中枢神经系统（cns）感染性疾病的诊断而言，目前的实验室pcr技术针对单一病原检测，费时费力，延误治疗进度，因此，亟需将pcr技术应用于hiv感染者中枢神经系统（cns）的颅内占位病变（bml），提高hiv感染者中枢神经系统（cns）感染性疾病的检测效率，以快速区分hiv感染者中枢神经系统（cns）是否发生了颅内病原感染，能够尽早对疑似病例做出正确的实验室诊断，对改善患者颅内感染性占位病变的预后工作具有极其重要的意义。

技术实现思路

1、鉴于上述的分析，本发明实施例旨在提供一种pcr检测试剂及方法和应用，用以解决现有的实验室pcr技术仅针对单一病原进行检测，费时费力，延误治疗进度，艾滋病中枢神经系统感染病原体的检测效率低的问题。

2、本发明的目的主要是通过以下技术方案实现的：

3、本发明提供了一种pcr检测试剂，所述检测试剂包括ebv dna扩增试剂、hcmv dna扩增试剂、hsv dna扩增试剂、tb dna扩增试剂、jcv dna扩增试剂和tg dna扩增试剂中的一种或几种；

4、所述ebv dna扩增试剂包括ebv正向引物、ebv反向引物；ebv正向引物的序列为：cagctttgacgatggagtag；ebv反向引物的序列为：cayctccdtcatctccgtcat；

5、所述hcmv dna扩增试剂包括hcmv的正向引物、hcmv反向引物；hcmv正向引物的序列为：cttcttatcaccatcagcg；hcmv反向引物的序列为：gacgctggtgggggtcggc；

6、所述hsv dna扩增试剂包括hsv的正向引物、hsv反向引物；hsv正向引物的序列为：ggyctgycccatccgaacg；hsv反向引物的序列为：caggtacgtrccsgcggtct；

7、所述tb dna扩增试剂包括tb正向引物、tb反向引物；tb正向引物的序列为：ctccgtacccggagcgccaa；tb反向引物的序列为：gaatcggtctggacgtcaagg；

8、所述jcv dna扩增试剂包括jcv正向引物、jcv反向引物；jcv正向引物的序列为：gctcatacctagggagcc；jcv反向引物的序列为：aggggtttcactataactg；

9、所述tg dna扩增试剂包括tg的正向引物、tg反向引物；tg正向引物的序列为：gagcacgcaaccctggacc；tg反向引物的序列为：cacctcagtctcttgcctgc。

10、进一步地，所述ebv dna扩增试剂还包括ebv荧光探针，ebv荧光探针的序列为：fam-cggcagccccttccaccatagg-bhq1；和/或，

11、所述hcmv dna扩增试剂还包括hcmv荧光探针，hcmv荧光探针的序列为：fam-ccacgctgacaacccactctt-bhq1；和/或，

12、所述hsv dna扩增试剂还包括hsv荧光探针，hsv荧光探针的序列为：agcgccgtcagcgaggat；和/或，

13、所述tb dna扩增试剂还包括tb荧光探针，tb荧光探针的序列为：fam-tctccttcgctaagctgcgc-bhq1；和/或，

14、所述jcv dna扩增试剂还包括jcv荧光探针，jcv荧光探针的序列为：fam-cagccagagggagccct-bhq1；和/或，

15、所述tg dna扩增试剂还包括tg荧光探针，tg荧光探针的序列为fam-tagcggaatgagcaattgtgc-bhq1。

16、本发明还提供了上述pcr检测试剂的应用，所述应用包括以下任一项：

17、检测引发艾滋病中枢神经系统感染病原体；

18、制备用于检测引发艾滋病中枢神经系统感染病原体的试剂盒；

19、检测待测样本是否含有引发艾滋病中枢神经系统感染病原体；

20、制备用于检测待测样本是否含有引发艾滋病中枢神经系统感染病原体的试剂盒。

21、本发明还提供了一种艾滋病中枢神经系统感染的pcr检测试剂盒，所述试剂盒包括上述pcr检测试剂中的六种扩增试剂。

22、进一步地，上述pcr检测试剂盒中，所述ebv正向引物的原始浓度为50μm，在25μl反应体系中的终浓度为300nm；所述ebv反向引物的原始浓度为50μm，在25μl反应体系中的终浓度为300nm；所述ebv荧光探针的原始浓度为50μm，在25μl反应体系中的终浓度为150nm。

23、进一步地，所述ebv dna扩增试剂、hcmv dna扩增试剂、hsv dna扩增试剂、tb dna扩增试剂、jcv dna扩增试剂和tg dna扩增试剂中还分别包括taq dna 聚合酶，氯化镁溶液，氯化钾溶液，dntps，tris-hcl缓冲液，所述tris-hcl缓冲液的ph为8.0。

24、进一步地，所述taq dna 聚合酶的原始浓度为5u/μl，在25μl反应体系中的终浓度为1u/μl；

25、所述氯化镁溶液的原始浓度为1m，在25μl反应体系中的终浓度为1mm；

26、所述氯化钾溶液的原始浓度为1m，在25μl反应体系中的终浓度为30mm；

27、所述dntps的原始浓度为10mm，在25μl反应体系中的终浓度为0.4mm；

28、所述tris-hcl缓冲液（ph8.0）的原始浓度为200mm，在25μl反应体系中的终浓度为20mm。

29、进一步地，所述试剂盒为6孔以上，每孔中包含一种扩增试剂。

30、本发明还提供了一种艾滋病中枢神经系统感染病原体的pcr检测方法，使用上述pcr检测试剂盒进行检测，包括以下步骤：

31、s1：提取待测样本dna；

32、s2：制备扩增体系，完成pcr扩增反应；

33、s3：收集fam检测通道荧光信号，得到检测结果。

34、进一步地，所述pcr扩增反应的条件为：预变性温度：95℃；预变性时间：5min；然后95℃ 15s，60℃ 35s，在60℃进行荧光检测，交替进行 50个循环。

35、与现有技术相比，本发明至少可实现如下有益效果之一：

36、1、本发明通过设计人颅内 eb病毒（ebv）、人巨细胞病毒（hcmv）、单纯疱疹病毒（hsv）、结核分枝杆菌（tb）、jc多瘤病毒（jcv）和弓形虫（tg）的引物和荧光标记探针，开发了一种pcr检测试剂，可以用于检测待测样本是否感染单一或多种病原体或制备用于检测感染单一或多种病原体的试剂盒，节约成本，检测效率高。

37、2、本发明提供的艾滋病中枢神经系统感染的pcr检测试剂盒和检测方法，通过一个pcr反应，可以从核酸样本中同时检测出样本是否有eb病毒（ebv）、人巨细胞病毒（hcmv）、单纯疱疹病毒（hsv）、结核分枝杆菌（tb）、jc多瘤病毒（jcv）和弓形虫（tg）的存在，较于pcr技术针对单一病原检测可以节约成本、重复性好，可以快速有效的判定hiv感染者中枢神经系统（cns）的颅内占位病变（bml），提高了hiv感染者中枢神经系统（cns）感染性疾病的检测效率。

38、3、本发明提供的艾滋病中枢神经系统感染的pcr检测试剂盒的设计基本涵盖了常见的艾滋病继发性感染的相关病原体，检测较为全面，可以实现诊断快速，让患者能早期获得有针对性的诊断，可以尽早进行下一步有针对性的治疗，缩短病程，减轻感染对中枢神经系统带来更多的损伤。

39、本发明中，上述各技术方案之间还可以相互组合，以实现更多的优选组合方案。本发明的其他特征和优点将在随后的说明书中阐述，并且，部分优点可从说明书中变得显而易见，或者通过实施本发明而了解。本发明的目的和其他优点可通过说明书以及附图中所特别指出的内容中来实现和获得。