β-Estradiol小分子夹心法ELISA检测试剂盒及其制备方法与流程

本发明专利涉及免疫学检测，尤其是指一种β-estradiol小分子夹心法elisa检测试剂盒及其制备方法。

背景技术：

1、β-estradiol是一种类固醇激素，主要由卵巢滤泡、黄体及妊娠时胎盘分泌，是雌激素中最主要、生物活性最强的激素。它是性腺激素检测中的一项重要指标，生理作用最重要的成分，其主要作用是促进女性生殖器官的发育、维持第二性征和生殖功能，该指标升高常见于多胎妊娠、糖尿病孕妇、肝硬化、卵巢癌、男性乳腺发育症、女性性早熟，该指标降低常见于妊娠高血压综合症、皮质醇增多症、葡萄糖患者、更年期综合症

2、目前常用的β-estradiol检测方法包括：高效液相色谱图法、化学发光磁珠法以及elisa竞争法等方法。高效液相色谱法检测成本高，检测通量低，不适合科研大批量样本的检测；化学发光磁珠法操作便捷度差且反应机理与elisa竞争法相似，检测结果差异大；elisa竞争法检测存在检测灵敏度不足、批内批间差大、稀释和加标回收率差及难以大规模工业化生产的问题。

技术实现思路

1、本发明旨在至少在一定程度上解决现有技术中存在的技术问题之一，由此，在本发明的第一方面，本发明提供一种β-estradiol抗原表位，β-estradiol抗原表位选自如下结构中的一种：

2、

3、

4、在本发明的第二方面，本发明提供一种β-estradiol抗原，所述β-estradiol抗原通过本发明第一方面所述β-estradiol抗原表位与ova或klh进行偶联获得。

5、在本发明的第三方面，本发明提供一种β-estradiol特异性包被抗体，由本发明第二方面所述的β-estradiol抗原制备得到。

6、在本发明的第四方面，本发明提供一种β-estradiol特异性检测抗体，由本发明第二方面所述的β-estradiol抗原制备得到的抗体进行生物素标记得到。

7、优选地，β-estradiol特异性包被抗体与生物素的摩尔比在1:10-1:40，标记缓冲液ph为7.4-8.0。

8、在本发明的第五方面，本发明提供一种elisa检测试剂盒，所述elisa检测试剂盒包括本发明第三方面所述的β-estradiol特异性包被抗体、本发明第四方面所述的β-estradiol特异性检测抗体、标准品、streptavidin-hrp、单组分tmb显色液、终止液以及稀释液。

9、优选地，所述elisa检测试剂盒采用双抗体夹心法检测β-estradiol，所述双抗体夹心法采用第一抗β-estradiol特异性包被抗体作为包被抗体，所述第一抗β-estradiol特异性包被抗体来源于权利要求1所述的β-estradiol抗原表位中的一种，所述双抗体夹心法采用第二抗β-estradiol特异性检测抗体作为检测抗体，所述第二抗β-estradiol特异性检测抗体来源于权利要求1所述的β-estradiol抗原表位中的另一种。

10、优选地，所述β-estradiol特异性包被抗体的浓度为1-6μg/ml。

11、优选地，所述β-estradiol特异性检测抗体的质量浓度为1:2000-1:20000。

12、在本发明的第六方面，本发明提供一种检测β-estradiol的双抗体夹心法，包括如下步骤：

13、1)以式3化合物、式4化合物作为抗原，免疫动物，获得杂交瘤细胞；

14、2)通过杂交瘤细胞，制备单克隆抗体；

15、3)对单克隆抗体的表位进行鉴定，得到已知表位的单克隆抗体，选取两株不同表位的单克隆抗体，将其中一株与生物素进行反应，得到一株标记生物素的抗体和一株未标记生物素的抗体；

16、4)以未标记生物素的抗体作为包被抗体，标记生物素的抗体作为检测抗体进行抗体配对，然后根据抗体配对数据和夹心法对β-estradiol进行检测；

17、所述式3化合物、式4化合物如下所示：

18、

19、β-estradiol(17β-oh)-klh的结构如下式4所示：

20、

21、在本发明中，所述稳定性检测验证是指试剂盒37℃整体稳定性在90-110％之间。

22、在本发明中，所述小鼠血清血浆检测验证是指小鼠血清血浆均可检出值，小鼠均为spf级balb/c小鼠。

23、在本发明中，所述回收率及批内批间差检测验证是指稀释回收率与加标回收率符合80-120％的范围要求，批内差＜10％、批间差＜15％。

24、在本发明中，所述特异性检测验证是指验证后与相关结构类似物无明显交叉反应(交叉反应率＜15％)，结构类似物为17-epi estradiol valerate、3-valerateestradiol、estradiolbenzoate、estriol。

25、本发明的工作原理：分子量相对较小的半抗原在与抗体结合后被深埋在抗原结合位点，经研究试验，当一个小分子有4个或以上的环状结构时，分别对这个小分子上相隔7-9个碳原子的两个官能团(本发明中的第3位oh和第17β位oh)进行改造衍生出可以偶联氨基的中间品，然后分别与不同载体蛋白klh或者ova偶联，接着将两个偶联物作为免疫原分别免疫动物后制备小鼠杂交瘤单抗用于双抗体夹心法试剂盒开发。

26、本发明有益效果：

27、1、提供一种检测灵敏度高、批内批间差小、稀释和加标回收率好、易于实现工业化生产且重复性好的β-estradiol elisa检测试剂盒。

28、2、与现有的β-estradiol小分子竞争法elisa试剂盒相比，本发明首次提供基于双抗体夹心法的小分子试剂盒制备方法，有效解决了传统β-estradiol小分子竞争法elisa试剂盒测样cv大、灵敏度不足、不能实现工业化稳定生产的问题。

技术特征：

1.一种β-estradiol抗原表位，其特征在于：β-estradiol抗原表位如下：

2.一种β-estradiol抗原，其特征在于：所示β-estradiol抗原通过权利要求1所述β-estradiol抗原表位的酚羟基或五元环羟基改造后与ova或klh进行偶联获得。

3.一种β-estradiol特异性包被抗体，其特征在于：由权利要求2所述的β-estradiol抗原制备得到。

4.一种β-estradiol特异性检测抗体，其特征在于：由权利要求2所述的β-estradiol抗原制备得到的抗体进行生物素标记得到。

5.一种elisa检测试剂盒，其特征在于：所述elisa检测试剂盒包括权利要求3所述的β-estradiol特异性包被抗体、权利要求4所述的β-estradiol特异性检测抗体、标准品、streptavidin-hrp、单组分tmb显色液、终止液以及稀释液。

6.根据权利要求5所述的elisa检测试剂盒，其特征在于：所述elisa检测试剂盒采用双抗体夹心法检测β-estradiol，所述双抗体夹心法采用第一抗β-estradiol特异性抗体作为包被抗体，所述第一抗β-estradiol特异性包被抗体来源于权利要求1所述的β-estradiol抗原表位中的一种，所述双抗体夹心法采用第二抗β-estradiol特异性抗体作为检测抗体，所述第二抗β-estradiol特异性检测抗体来源于权利要求1所述的β-estradiol抗原表位中的另一种。

7.根据权利要求5所述的elisa检测试剂盒，其特征在于：所述β-estradiol特异性包被抗体的浓度为1-6μg/ml。

8.根据权利要求5所述的elisa检测试剂盒，其特征在于：所述β-estradiol特异性检测抗体的质量浓度为1:2000-1:20000。

9.一种检测β-estradiol的双抗体夹心法，其特征在于，包括如下步骤：

技术总结
本发明提供一种β‑Estradiol抗原表位，β‑Estradiol抗原，β‑Estradiol特异性包被抗体，β‑Estradiol特异性检测抗体，本发明还提供一种ELISA检测试剂盒，所述ELISA检测试剂盒包括β‑Estradiol特异性包被抗体、β‑Estradiol特异性检测抗体、标准品、Streptavidin‑HRP、单组分TMB显色液、终止液以及稀释液。该试剂盒适用于科研实验室动物血清血浆等样本的检测，它解决了传统小分子β‑Estradiol竞争法ELISA检测试剂盒灵敏度不足、批内批间差大、稀释和加标回收率差及难以大规模工业化生产的问题。

技术研发人员：冷毅斌,胡勤芹,杨飞,朱峰胜
受保护的技术使用者：伊莱瑞特（武汉）生物技术有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/3/21