一种生产以Tn抗原修饰为主的糖肽的动物细胞株及其构建方法

本发明属于，具体涉及到一种表达tn抗原修饰的癌抗原125肽细胞的构建方法。

背景技术：

1、癌抗原125(cancer antigen 125,ca125)是粘蛋白muc16的重复肽表位，具有高度糖基化修饰。ca125是一种与卵巢癌相关的抗原，存在于上皮性卵巢癌组织和患者血清中，是目前卵巢恶性肿瘤血清肿瘤标志物的“金标准”，主要用于辅助诊断恶性浆液性卵巢癌，上皮性卵巢癌，同时也是作为手术切除化疗后疗效观察的指标，有较大的临床价值。根据研究显示，血清ca125水平在其他良性疾病中也有异常的上升，如子宫内膜异位症、急性盆腔炎、盆腔结核等。同时，良性疾病和恶性疾病患者的临床表现很相似，这对于诊断治疗方案的制定带来了不必要的困难。然而，来源于良性和恶性疾病的ca125上o糖基化是有所不同的。由于恶性肿瘤细胞糖基化修饰途径中某些糖基转移酶表达量的升高或者降低，其中ca125上的o糖基化修饰与良性疾病中有一定的差异，如tn糖抗原和stn糖抗原以及t糖抗原。通过检测和分析ca125上糖基化的差异，以此来区分良性或者恶性疾病所引起的ca125表达升高，进而提高诊断治疗的精准性。

2、利用构建的哺乳动物细胞株生产表达携带稳定tn糖抗原修饰的ca125标准品，可以以此对比和确定患者体内高表达ca125的糖基化修饰水平，从而得到更精确的诊断。以往携带稳定tn糖抗原修饰的ca125标准品的制备是直接从肿瘤细胞上清中纯化而来，但是由于非特异性吸附的损失，会导致ca125的产率较低；另外，由于肿瘤细胞上清的分子成分较为复杂，导致ca125的纯度较低；最后，肿瘤组织中的糖基化修饰程度不一致，会造成ca125上tn抗原修饰的不确定。

技术实现思路

1、本部分的目的在于概述本发明的实施例的一些方面以及简要介绍一些较佳实施例。在本部分以及本申请的说明书摘要和发明名称中可能会做些简化或省略以避免使本部分、说明书摘要和发明名称的目的模糊，而这种简化或省略不能用于限制本发明的范围。

2、鉴于上述和/或现有技术中存在的问题，提出了本发明。

3、因此，本发明的目的是，克服现有技术中的不足，提供一种表达tn抗原修饰的癌抗原125肽细胞的构建方法。

4、为解决上述技术问题，本发明提供了如下技术方案：一种表达tn抗原修饰的癌抗原125肽细胞，其特征在于：包括，

5、所述tn抗原为单个n-乙酰葡糖胺修饰在o糖基化修饰位点丝氨酸/苏氨酸上；所述动物细胞株为c1galt1-slc35a1基因双敲除细胞株cs-ko高表达ca125肽后敲除基因pgap2后最终得到c1galt1-slc35a1-pgap2-ko三基因敲除细胞。

6、作为本发明所述制备方法的一种优选方案，其中：所述细胞选自人胚胎肾细胞hek293、中国仓鼠卵巢细胞cho、cos、3t3、myeloma、bhk、hela、vero中的哺乳动物细胞；所述细胞株来自人胚胎肾细胞hek293。

7、作为本发明所述制备方法的一种优选方案，其中：将动物细胞高尔基体中的糖蛋白-n-乙酰半乳糖胺3-β-半乳糖基转移酶i c1galt1，cmp-唾液酸转运蛋白基因slc35a1进行敲除或破坏，得到c1galt1-slc35a1基因双敲除细胞株cs-ko；构建表达ca125质粒，其中ca125的n端具有gpi锚定蛋白cd59的信号肽和用于检测的ha标签，c端具有gpi锚定信号序列、his和strep ii纯化标签；在细胞中表达ca125肽后，使用抗生素筛选得到稳定细胞株，将ca125通过gpi锚定在细胞膜表面；最后对后糖基磷脂酰肌醇附着因子基因pgap2进行敲除或破坏，得到c1galt1-slc35a1-pgap2-ko三基因敲除细胞。

8、作为本发明所述制备方法的一种优选方案，其中：所述半乳糖基转移酶基因的dna序列如seq id no.1所示，选自人胚胎肾细胞hek293，其序列编码的蛋白的氨基酸序列具有20％以上的同源性且具有半乳糖基转移酶活性的蛋白。

9、作为本发明所述制备方法的一种优选方案，其中：所述唾液酸转运酶基因的蛋白序列如seq id no.2所示，选自人胚胎肾细胞hek293，其序列编码的蛋白的氨基酸序列具有20％以上的同源性且具有唾液酸转运酶活性的蛋白。

10、作为本发明所述制备方法的一种优选方案，其中：所述后糖基磷脂酰肌醇附着因子基因的蛋白序列如seq id no.3所示，选自人胚胎肾细胞hek293，其序列编码的蛋白的氨基酸序列具有20％以上的同源性且具有后糖基磷脂酰肌醇附着因子活性的蛋白。

11、作为本发明所述制备方法的一种优选方案，其中：所述ca125肽为粘蛋白muc16其中重复表位中的一段，蛋白序列如seq id no.4所示。

12、作为本发明所述制备方法的一种优选方案，其中：所述ca125肽添加糖基磷脂酰肌醇(gpi)信号肽，稳定表达为gpi形式。

13、作为本发明所述制备方法的一种优选方案，其中：所述设计敲除基因c1galt1引物的序列如seq id no.5～seq id no.10所示，所述设计敲除基因slc35a1引物的序列如seqid no.11～seq id no.16所示；所述设计敲除基因pgap2引物的序列如seq id no.17～seqid no.22。

14、作为本发明所述制备方法的一种优选方案，其中：所述基因c1galt1靶序列如seqid no.23～24所示，slc35a1靶序列如seq id no.25～26所示，pgap2靶序列如seq idno.27～28所示。。

15、本发明的再一个目的是，克服现有技术中的不足，提供一种表达tn抗原修饰的癌抗原125肽细胞的构建方法。

16、本发明有益效果：

17、(1)本发明通过crispr-cas9基因编辑技术先敲除c1galt1基因，再敲除slc35a1基因，简化了蛋白质的o糖基化修饰，成功构建了双基因敲除细胞株。该细胞株可表达稳定tn糖抗原的o糖基化修饰。

18、(2)本发明利用此细胞株，可在细胞表面表达生产携带稳定tn糖抗原的o糖基化修饰的gpi锚定膜结合型的ca125糖肽。

19、(3)本发明利用gpi锚定蛋白的特性筛选出高表达ca125的细胞株后，通过敲除pgap2使得gpi锚定ca125转变为可溶性蛋白分泌至培养基中，更方便收集纯化，便于获取。

技术特征：

1.一种生产以tn抗原修饰为主的糖肽的动物细胞株，其特征在于：包括，

2.根据权利要求1所述的动物细胞株，其中，所述细胞选自人胚胎肾细胞hek293、中国仓鼠卵巢细胞cho、cos、3t3、myeloma、bhk、hela、vero中的哺乳动物细胞；所述细胞株来自人胚胎肾细胞hek293。

3.根据权利要求1或2所述的动物细胞株的构建方法，其特征在于：包括，

4.根据权利要求3所述的动物细胞株的构建方法，其特征在于：所述半乳糖基转移酶基因的dna序列如seq id no.1所示，选自人胚胎肾细胞hek293，其序列编码的蛋白的氨基酸序列具有20％以上的同源性且具有半乳糖基转移酶活性的蛋白。

5.根据权利要求3所述的动物细胞株的构建方法，其特征在于：所述唾液酸转运酶基因的dna序列如seq id no.2所示，选自人胚胎肾细胞hek293，其序列编码的蛋白的氨基酸序列具有20％以上的同源性且具有唾液酸转运酶活性的蛋白。

6.根据权利要求3所述的动物细胞株的构建方法，其特征在于：所述后糖基磷脂酰肌醇附着因子ii基因的dna序列如seq id no.3所示，选自人胚胎肾细胞hek293，其序列编码的蛋白的氨基酸序列具有20％以上的同源性且具有后糖基磷脂酰肌醇附着因子活性的蛋白。

7.根据权利要求3所述的动物细胞株的构建方法，其特征在于：所述ca125肽为粘蛋白muc16其中重复表位中的一段，氨基酸序列如seq id no.4所示。

8.根据权利要求7所述的动物细胞株的构建方法，其特征在于：所述ca125肽添加糖基磷脂酰肌醇(gpi)信号肽，稳定表达为gpi形式。

9.根据权利要求3所述的动物细胞株的构建方法，其特征在于：所述设计敲除基因c1galt1引物的序列如seq id no.5～seq id no.10所示，所述设计敲除基因slc35a1引物的序列如seq id no.11～seq id no.16所示；所述设计敲除基因pgap2引物的序列如seqid no.17～seq id no.22。

10.根据权利要求7所述的动物细胞株的构建方法，其特征在于：所述基因c1galt1靶序列如seq id no.23～24所示，slc35a1靶序列如seq id no.25～26所示，pgap2靶序列如seqid no.27～28所示。

技术总结
本发明公开了一种表达Tn抗原修饰的癌抗原125肽细胞的构建方法，包括，通过CRISPR/Cas9基因敲除技术，在人胚胎肾细胞293(HEK293)O糖基化路径中敲除先后敲除编码核心1β1‑3‑半乳糖基转移酶1基因C1GALT1，编码CMP‑唾液酸转运蛋白基因SLC35A1，构建了能在细胞中稳定生产表达Tn抗原表位的敲除细胞株；在敲除细胞株中表达GPI锚定膜结合型的CA125糖肽，并进一步敲除GPI合成路径中的后GPI附着蛋白因子2基因PGAP2，使得稳定过表达的GPI锚定CA125转为可溶形式分泌至培养基中；最后利用流式分析以及蛋白质印迹法，验证了相比于野生型HEK293细胞株所生产的CA125，敲除细胞株所生产的CA125主要携带Tn糖抗原修饰。

技术研发人员：柳艺石,藤田盛久,汤虞荷
受保护的技术使用者：江南大学
技术研发日：
技术公布日：2024/3/27