一种过表达稳转细胞株的快速构建方法及其应用与流程

本发明属于生物，具体涉及一种过表达稳转细胞株的快速构建方法及其应用。

背景技术：

1、过表达细胞株的构建是将外源基因导入宿主细胞，随后利用引入宿主内的抗性基因进行筛选，并鉴定得到外源(目的)基因持续表达的细胞株。过表达细胞株常见的构建方法有质粒瞬时转染和稳定性转染两种方式。质粒瞬时转染主要依赖于随机整合，这种方式存在效率低，筛选时间长，所得细胞株稳定性差等问题，其质粒在整个转染过程中，外源基因并不会整合到细胞的基因组中，而是存在于游离的载体上,这样可以在短时间内获得基因的表达产物，但随着细胞的不断分裂增殖外源基因最终会丢失。相对于瞬时转染，稳定性转染的外源基因会整合到宿主染色体中，随细胞分裂增殖稳定遗传下去，通过选择性标记筛选可得到稳定转染的细胞株，但是常规的方法需要同源臂克隆并进行载体的二次构建，对生物分子技术要求较高，且时间成本投入较高；也有以线性化的单链或者双链dna片段作为供体借助非同源末端连接(nhej)机制实现目的序列的定点敲入，但是其存在制备成本高、细胞毒性大等问题。在生物医药研究过程中往往涉及细胞稳转株的快速构建，如各实验室急需快速构建人ace2过表达细胞株用于病毒及疫苗相关研究，因此寻找一种操作简单、通用性强、减少载体构建时间，节约成本的方法是非常有必要的。

技术实现思路

1、基于以上背景，本发明提供出一种过表达稳转细胞株的快速构建方法及其应用，可避开常规稳定性转染时基因定点敲入同源臂装载涉及的二次载体构建的问题，实现稳定细胞株的快速构建。

2、本发明的技术方案为：

3、一种过表达稳转细胞株的快速构建方法，将crispr/cas9一体化载体与供体质粒对宿主细胞进行共转染；

4、所述供体质粒含有ampr基因和待整合基因；

5、所述crispr/cas9一体化载体含有sgrna1、sgrna2、cas9基因，所述sgrna1靶向切割细胞基因组上的hprt基因(次黄嘌呤磷酸核糖转移酶)，所述sgrna2靶向切割供体质粒的ampr基因(氨苄青霉素抗性基因)；

6、所述sgrna1的核苷酸序列如seq id no.1所示；

7、所述sgrna2的核苷酸序列如seq id no.2所示；

8、编码cas9蛋白的cas9基因的核苷酸序列如seq id no.3所示。

9、进一步地，所述crispr/cas9一体化载体可以选用px330、px458、px459等载体为骨架进行构建。

10、进一步地，所述供体质粒可以选用含有ampr基因的质粒，例如含有ampr基因的pcmv、plvx、pcdna，pcaggs等质粒。

11、进一步地，所述细胞株为野生型293t细胞。

12、基于同一发明构思，本发明还提供了上述的crispr/cas9一体化载体的构建方法，其包括如下步骤，

13、1)使用限制性核酸内切酶noti和afliii酶切aavs1 t2 cripr in px330载体框架并回收。

14、2)更改抗性基因

15、以pegfp-c1-tp53为模板，扩增卡那霉素抗性基因编码序列，并与步骤1)回收的载体框架连接转化，获得px330kr-aavs1；

16、卡那霉素抗性基因编码序列扩增引物如下：

17、引物kr-fw：aggcatgctggggagcggccgccaggtggcacttttcgggg(seq id no.4)；

18、引物kr-rv：gggaaataggccctcacatgtaagcttatgcatggcggtaatacgg(seq idno.5)；

19、3)xbai单酶切px330kr-aavs1，回收框架；

20、pcr扩增制备片段1(u6启动子、273bp)和片段2(ampr-sgrna序列、150bp)，重组连接，获得px330kr-aavs1-ampr；

21、片段1的扩增引物如下：

22、引物1-1：ctgcagacaaatggctctagagagggcctatttcccatg(seq id no.6)；

23、引物1-2：tccggtgtttcgtcctttcc(seq id no.7)；

24、片段2的扩增引物如下：

25、引物2-1：ggaaaggacgaaacaccggatcgaactggatctcaacaggttttagagctagaaatagc(seq id no.8)；

26、引物2-2：tatgtaacgggtacctctagaggccggccaaaaaagcaccgactcggtgccac(seq idno.9)；

27、所述片段1、片段2的pcr模板均来自aavs1 t2 cripr in px330质粒。

28、4)hindiii和xbai双酶切px330kr-aavs1-ampr，回收框架；

29、片段1(u6启动子、273bp)和片段2(ampr-sgrna序列、150bp)重叠延伸pcr后，与片段3(hprt-sgrna、415bp)一起与框架重组，获得px330kr-hprt-ampr；

30、片段3的扩增引物如下：

31、引物3-1：ggatccctcgagctgcagacaaatggctctaga(seq id no.10)；

32、引物3-2：tatgtaacgggtacctct(seq id no.11)；

33、片段3的pcr模板来自于px330kr-aavs1-ampr(cutter)质粒。

34、基于同一发明构思，本发明将采用上述构建方法所构建的过表达稳转细胞株应用于医药生物学领域，特别是基因功能研究或药物筛选或抗体滴度测定或疫苗评价。基于同一发明构思，本发明还提供了一种人ace2过表达稳转细胞株的构建方法，其包括如下步骤：

35、1)复苏野生型293t细胞，接种于培养皿中进行传代培养；

36、2)待步骤1)的细胞汇合度达到65-75％后，对野生型293t细胞中以1:1的重量比共转染crispr/cas9一体化载体、plvx-ace2质粒，转染24h后，进行嘌呤霉素筛选后，获得能够过表达ace2蛋白的ace2-293t细胞株；

37、其中所述plvx-ace2质粒含有ampr基因和嘌呤霉素抗性基因；

38、基于同一发明构思，本发明将采用上述构建方法所所构建的人ace2过表达稳转细胞株用于医药生物学领域，特别是基因功能研究或药物筛选或抗体滴度测定或疫苗评价。

39、基于同一发明构思，本发明还提供了一种bfp(蓝色荧光蛋白)过表达稳转细胞株的构建方法，其包括如下步骤：

40、1)复苏野生型293t细胞，接种于培养皿中进行传代培养；

41、2)待步骤1)的细胞汇合度达到65-75％后，对野生型293t细胞中以1:1的重量比共转染crispr/cas9一体化载体、pcmv-bfp质粒，转染24h后，进行嘌呤霉素筛选后，获得能够表达蓝色荧光的bfp-293t细胞株；

42、所述pcmv-bfp质粒含有ampr基因和嘌呤霉素抗性基因。

43、相比现有技术，本发明的有益效果为：

44、本发明采用crispr/cas9一体化载体与供体质粒对宿主细胞进行共转染，通过2个sgrna分别对待敲入质粒(供体质粒)的ampr基因和宿主细胞特定基因位点hprt基因同时进行切割，通过诱导非同源末端连接(nhej)的修复方式实现全质粒定点整合，无需二次载体构建，无需线性dna片段转染，即可快速获得目的序列稳定表达的细胞株，构建时间短，实验成本低，且商品化的ampr抗性质粒易于获得，非常适用于突发公共卫生事件急需过表达细胞株以及分子实验技术相对薄弱的科研工作者进行过表达细胞株的快速构建。