一种角质细胞生长因子-透皮肽融合蛋白及其制备与应用

本发明涉及一种融合蛋白，具体涉及一种角质细胞生长因子-透皮肽融合蛋白及其制备与应用。

背景技术：

1、角质细胞生长因子-2(kgf-2)是成纤维细胞生长因子(fgfs)家族的重要一员，yamasaki等在1996年从大鼠胚胎的角质细胞中分离出一种新型细胞因子，命名为kgf-2。kgf-2是一个n端含40个氨基酸信号肽，由208个氨基酸残基组成的蛋白分子。kgf-2有促进表皮及眼角膜损伤的修复，并参与胚胎中肺发育的全过程。除此之外，kgf-2在毛发生长的过程中有显著的促进作用，由于kgf-2为蛋白分子，副作用较米诺地尔小，是生发药物最具潜力的候选物质。

2、但目前开发生发剂的关键是经皮药物的稳定性和透皮效率，因此提高kgf-2的稳定性及透皮率是其成为生发剂的首要解决的问题。目前已经采用一些方式增加kgf-2的透皮性，如采用物理方法的将kgf吸附在微针上，利用微针将kgf-2直接递送到真皮层；有将kgf-2融合聚乙二醇(peg)增加细胞膜的亲和性将kgf-2递送入真皮层。然而，上述方法对kgf-2的稳定性造成不可逆的影响，同时也会影响使用者的体验感。

技术实现思路

1、本发明的目的是提供一种角质细胞生长因子-透皮肽融合蛋白及其制备与应用，解决了现有技术对kgf-2的稳定性造成不可逆的影响，同时也会影响使用者的体验感的问题。

2、为了达到上述目的，本发明提供了一种角质细胞生长因子-透皮肽融合蛋白，该蛋白的氨基酸序列如seq id no.12所示。

3、本发明提供了一种编码如所述的融合蛋白的基因，该基因的核苷酸序列如seq idno.8所示。

4、本发明提供了一种含有如所述的基因的重组载体。

5、优选地，所述重组载体采用pgm3301。

6、本发明提供了一种包含如所述的重组载体的重组菌。

7、本发明提供了一种如所述的融合蛋白在作为制备促生发剂中的应用。

8、本发明提供了一种表达如所述的融合蛋白的拟南芥转化株系的制备方法，该方法包含：

9、(1)将tp-1基因和kgf-2基因，用t4连接酶连接入pgm3301载体中，将连接产物转化大肠杆菌，筛选出包含如所述的融合蛋白的基因，将构建的载体命名为pgm3301-tp1-kgf2，提取pgm3301-tp1-kgf2载体质粒；其中，所述tp-1基因的核苷酸序列如seq id no.6，所述kgf-2基因的核苷酸序列如seq id no.7，所述pgm3301-tp1-kgf2基因的核苷酸序列如seqid no.8；

10、(2)将提取的pgm3301-tp1-kgf2载体质粒通过冻融法转入eha105农杆菌感受态中，用pcr法筛选出鉴定含有pgm3301-tp1-kgf2质粒的农杆菌；将鉴定好的农杆菌置于28℃、230rpm的转速下培养，使农杆菌液的吸光度od590达到1.0，利用离心法收集培养后的农杆菌；其中，其中，所述pcr法采用的第一组上游引物的核苷酸序列如seq id no.1，下游引物的核苷酸序列如seq id no.2，第二组上游引物的核苷酸序列如seq id no.3，下游引物的核苷酸序列如seq id no.4；

11、(3)将收集好的农杆菌混入转化液中，将拟南芥花序浸入转化液，将转化后的拟南芥置于暗处并收集转化后的拟南芥的种荚，阴干并去壳收种，播种命名为t1，持续播种2代筛选出纯合转化株系命名为t3，该纯合转化株系t3能够表达如所述的融合蛋白。

12、本发明提供了一种含有如所述的融合蛋白的拟南芥转化株系的筛选方法，该方法包含：

13、(1)利用提基因组试剂盒提取拟南芥的全基因组，用pcr法将扩增产物通过琼脂糖凝胶分离，利用紫外成像仪检测；其中，所述pcr法采用的第一组上游引物的核苷酸序列如seq id no.1，下游引物的核苷酸序列如seq id no.2，第二组上游引物的核苷酸序列如seqid no.3，下游引物的核苷酸序列如seq id no.4；

14、(2)将pcr鉴定阳性的拟南芥取组织研磨成粉末，加入蛋白提取缓冲液得到混合液，冰浴；在4℃条件下，取冰浴后的混合液离心，加入上样缓冲液，沸水浴，将提取的拟南芥总可溶蛋白通过sds-page胶分离，利用转膜仪转到pvdf膜上，加入封闭液室温封闭，洗去封闭液加入抗kgf-2鼠抗体，4℃过夜孵育；洗去抗体加入碱性磷酸酶标记的羊抗鼠抗体，室温孵育；洗去羊抗鼠抗体加入显色剂bcip/nbt，放置在成像仪中检测；通过分子生物学的检测筛选出转化拟南芥高表达如所述的融合蛋白的株系。

15、本发明的一种角质细胞生长因子-透皮肽融合蛋白及其制备与应用，解决了现有技术对kgf-2的稳定性造成不可逆的影响，同时也会影响使用者的体验感的问题，具有以下优点：

16、1、本发明采用的拟南芥没有潜在致病的热源与内毒素，表明拟南芥是安全性很高的表达系统；而且拟南芥属真核生物，其具有完善的蛋白翻译后修饰功能，保证表达的外源蛋白可溶且具有生物有效性；同时拟南芥的种植、栽培与转化方式操作简单，可显著降低高附加值蛋白的生产成本，因此利用拟南芥生产kgf-2蛋白具有显而易见的优势。

17、2、本发明能提高kgf2的生物安全性和稳定性，不影响kgf2的生物学活性，融合了tp1的kgf2显著的提高kgf2的透皮率，并且极大提高了其促生发作用的应用前景；同时生物透皮给药也可以减少微针带来的疼痛感，此融合蛋白生产系统和凝胶制剂无任何潜在风险，减少了对于皮肤的伤害。

18、3、本发明融合蛋白生产系统制备简单，透皮效果明显，且从动物实验结果上看tp1与kgf2融合表达时对各自结构没有影响，也未对受试动物产生不良影响，因此该融合蛋白属于生物安全物质。

技术特征：

1.一种角质细胞生长因子-透皮肽融合蛋白，其特征在于，该蛋白的氨基酸序列如seqid no.12所示。

2.一种编码如权利要求1所述的融合蛋白的基因，其特征在于，该基因的核苷酸序列如seq id no.8所示。

3.一种含有如权利要求2所述的基因的重组载体。

4.根据权利要求3所述的重组载体，其特征在于，所述重组载体采用pgm3301。

5.一种包含如权利要求3或4所述的重组载体的重组菌。

6.一种如权利要求1所述的融合蛋白在作为制备促生发剂中的应用。

7.一种表达如权利要求1所述的融合蛋白的拟南芥转化株系的制备方法，其特征在于，该方法包含：

8.一种含有如权利要求1所述的融合蛋白的拟南芥转化株系的筛选方法，其特征在于，该方法包含：

技术总结
本发明公开了一种角质细胞生长因子‑透皮肽融合蛋白，该蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.12所示，编码如所述的融合蛋白的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示，含有如所述的基因的重组载体，所述重组载体采用pGM3301。本发明解决了现有技术对KGF‑2的稳定性造成不可逆的影响，同时也会影响使用者的体验感的问题。本发明能提高KGF2的生物安全性和稳定性，不影响KGF2的生物学活性，融合了TP1的KGF2显著的提高KGF2的透皮率，并且极大提高了其促生发作用的应用前景；同时生物透皮给药也可以减少微针带来的疼痛感，此融合蛋白生产系统和凝胶制剂无任何潜在风险，减少了对于皮肤的伤害。

技术研发人员：李校堃,林丽,高爽,龚方华,赵文刚,王云鹏,许诺
受保护的技术使用者：温州医科大学
技术研发日：
技术公布日：2024/3/24