一种双链DNA接头以及短DNA片段的检测方法与流程

本发明涉及分子生物学检测，具体而言，涉及一种双链dna接头以及短dna片段的检测方法。

背景技术：

1、近年来，生物医药企业对于外源dna片段的残留检测越来越严格。外源性dna属于生物制品工艺相关杂质，对其含量进行检测可以确认产品纯化工艺是否合理，即能否有效去除外源dna残余；同时可确认产品中杂质含量是否符合标准要求，该检测值是生物制品质量控制的重要参数之一。

2、外源dna的来源主要包括宿主细胞、质粒等。在各种试剂耗材原料中，残留的外源dna可能会对后续的科学研究及工业生产造成不良影响，如感染性风险、免疫原性风险等。常规的外源dna检测方法主要包括dna探针杂交法、荧光探针法、定量pcr法。目前的外源dna检测方法仅仅能实现100bp以上的残留片段的检出，无法实现更短片段dna的检出。由于很多管材试剂中的dna序列可能降解为短片段序列，若无法准确检出，则可能会忽略短片段(＜100bp)对于生产或科研的影响。

3、鉴于此，特提出本发明。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种双链dna接头以及短dna片段的检测方法以解决上述技术问题。

2、本发明是这样实现的：

3、第一方面，本发明提供了一种用于短dna片段检测的双链dna接头，其包括：如seqid no:1所示的第一接头和如seq id no:2所示的第二接头。

4、本发明基于接头建库和荧光定量原理，开发了一种用于检测短片段的双链dna接头。经过验证，本发明提供的双链dna接头具有短dna片段检测范围广的技术优势，对于任意的外源dna均具有良好的检出效果。此外，与现有的dna片段检测方法相比，本发明提供的双链dna接头能够实现更小dna片段的检出，最低能够将20bp长度的短dna片段检出，同时也能检测大于100bp的长片段。在未来能够用于试剂耗材等产品中的短片段残留检测，在外源dna残留检测方面具有广阔的应用前景。

5、第一接头的序列如下：

6、5'-gatcaacgcagagtggccacaactttgtacaagcgagttgt-3'(seq id no:1)；

7、第二接头的序列如下：

8、5'-caactcgcttgtacaaagttgtggccactctgcgttgatc-3'(seq id no:2)。

9、在本发明应用较佳的实施方式中，第一接头的5’端具有修饰基团。由于第一接头与第二接头部分互补配对，而修饰基团的设置有助于防止第一接头和第二接头相互自连。

10、在一种可选的实施方式中，修饰基团选自生物素(biotin)、异硫氰酸荧光素(fitc)、羧基荧光素(fam)、地高辛(dig)和羧基四甲基罗丹明(tamra)中的任意一种。

11、在一种可选的实施方式中，修饰基团选自生物素。

12、第二方面，本发明提供了一种试剂或试剂盒，其包括上述的双链dna接头。

13、在本发明应用较佳的实施方式中，试剂或试剂盒还包括检测引物，检测引物包括上游引物和下游引物，上游引物选自第一接头中的至少27个连续碱基；下游引物选自第二接头中的至少27个连续碱基。

14、例如上游引物和下游引物分别包括：27-35个连续碱基，或者上游引物和下游引物分别包括：27-35个连续碱基，或者上游引物和下游引物分别包括：30-35个连续碱基。

15、在一种可选的实施方式中，上游引物的核苷酸序列如seq id no:3所示，下游引物的核苷酸序列如seq id no:3所示。5'-tcaacgcagagtggccacaactttgta-3'(seq id no:3)。

16、第三方面，本发明还提供了一种短dna片段的检测方法，其包括如下步骤：

17、对待测dna样本进行末端修复，然后连接上述的双链dna接头获得连接产物，使用上述的检测引物对连接产物进行荧光定量pcr；根据阴性对照和所测dna样本的ct值差异判断待测dna样本中是否存在短dna片段。

18、经典的dna结构为双链、两末端为平齐结构，即平末端。然而天然条件的dna分子很可能并非以上这样理想的结构。因dna分子在自然环境中经不同程度的降解后，其残留片段可能较短(小于50bp)，并且末端可能并非平末端，而是在单链末端带有数个突出碱基的粘性末端。同时，自然存在的短片段dna分子由于可能有各种不同长度的片段混杂在一起，长度不能精确确定，故难以直接作出定量。本发明提供的短dna检测方法包括对待测dna样本进行末端修复，然后连接上述双链dna接头，针对连接产物进行荧光定量pcr，可以对自然环境中天然存在的dna片段或人工合成的dna片段进行定量检测。通过与阴性对照比较，通过ct值的差异判断待测dna样本中是否存在短dna片段(或是否存在短dna片段残留)。

19、在本发明应用较佳的实施方式中，根据阴性对照和所测dna样本的ct值差异判断待测dna样本中是否存在短dna片段的方法包括：若阴性对照和所测dna样本的ct值差异显著，且判断所测dna样本存在短dna片段。

20、若阴性对照和所测dna样本的ct值显著不显著，或熔解曲线峰形相同，则判断所测dna样本不存在短dna片段。

21、在本发明应用较佳的实施方式中，阴性对照为添加有双链dna接头的对照组。

22、在本发明应用较佳的实施方式中，待测dna样本为人工合成的随机dna短片段或天然dna短片段。

23、在一种可选的实施方式中，天然dna短片段来自环境样本、管材、设备、培养物、组织、血清或血液；

24、在一种可选的实施方式中，随机dna短片段或天然dna短片段是指dna片段小于100bp的dna短片段。

25、在本发明应用较佳的实施方式中，荧光定量pcr的反应体系包括：sybr mix、检测引物和连接产物；

26、在一种可选的实施方式中，检测引物的终浓度为0.4-0.5μm；

27、在一种可选的实施方式中，荧光定量pcr的反应条件包括：95℃，1-5min；94℃，5-20s，60℃，30s-35s，循环35-45次；然后进行熔解曲线分析。

28、在本发明应用较佳的实施方式中，末端修复是指：将待测dna样本的片段末端补平，并对待测dna样本的5'端进行磷酸化，在待测dna样本的3'端引入a碱基。

29、带有突出末端的双链dna分子不能直接进行连接反应。本发明采用dna末端修复法，将双链dna分子的突出末端进行修复，并在每条单链的3’端加上一个a碱基，以便于进行下一步的连接反应。末端修复可采用市售的快速末端修复/a尾添加试剂盒进行修复。最终获得末端修复并加a的双链dna分子。修复后的dna分子结构如图13所示。

30、在一种可选的实施方式中，末端修复的反应条件包括：95-105℃，2-10min；25-30℃，20min；72℃，1-20min。

31、双链结构的接头示意图参照图13所示，设置上述接头结构通过a－t配对原理，与制备好的双链dna通过磷酸键进行t4连接反应。

32、第四方面，本发明还提供了双链dna接头或上述试剂或试剂盒在短dna片段残留检测中应用，该应用不以疾病的诊断为目的。该应用场景包括不限于出/入境外来生物检测，法医或司法生物鉴定，试管、ep管、纤维素膜等中的残留dna检测。

33、本发明具有以下有益效果：

34、本发明提供的双链dna接头以及检测方法具有如下优势：

35、(1)具有检测准确度高。本发明提供的检测方法能够检测试剂耗材等残留的双链dna片段，通过染料法绝对定量测定连接产物的含量，具有较高的准确性。

36、(2)省时简便。本发明中利用特异性接头建库连接和荧光定量方法测定短片段双链，测试实验耗时约为4-6h，能够节约测试时间。

37、(3)检测下限低。本发明可以最低测到20bp的双链片段，检测范围下限更低。

38、(4)具有检测应用的普适性，本发明提供的双链dna接头具有短dna片段检测范围广的技术优势，对于任意的外源dna均具有良好的检出效果。针对外源残留dna检测时，无需针对特定的dna样本设计特异性引物。