一种作为水产品保鲜剂的鱼鳞蛋白糖肽及其制备方法与流程

本发明涉及蛋白质工程，尤其涉及一种作为水产品保鲜剂的鱼鳞蛋白糖肽及其制备方法。

背景技术：

1、冷藏冷冻作为一种常用的鱼肉保鲜方式，通过降低内源酶活性和微生物的生长代谢速率，延长水产品的贮藏时间。鱼肉贮藏期间，鱼肉会出现感官品质劣变、菌落总数超标、蛋白质降解、脂肪氧化、水分流失等现象。目前水产品保鲜的方法主要包括物理保鲜(低温保鲜、气调保鲜和辐照保鲜)、化学保鲜(天然产物及其提取物和合成保鲜剂)和生物保鲜(ε-聚赖氨酸、乳酸菌等微生物来源的保鲜剂)等。

2、但是，水产品由于脂肪和蛋白含量较高，物理保鲜的效果通常不太理想，化学保鲜或生物保鲜剂容易对鱼肉的食用品质产生影响。因此，如何利用鱼体自身的蛋白质，通过生物技术开发具有特定功能的蛋白糖肽，应用于鱼肉中，开发同时具有高效保鲜作用的鱼肉保鲜剂，对于延长鱼肉货架期和提升产品品质具有重要意义。

技术实现思路

1、为了弥补现有技术的缺陷，本发明提供一种作为水产品保鲜剂的鱼鳞蛋白糖肽及其制备方法。

2、第一方面，本发明提供一种鱼鳞蛋白糖肽的制备方法，包括如下步骤：以鱼鳞为原料，将经预处理后的原料进行复合酶酶解制得酶解产物；所述酶解产物经超滤分离纯化得到蛋白肽液，所述蛋白肽液中含有50％以上pro-gly-lys-asn-gly-glu-asp-gly-glu-ser-gly所示的蛋白肽，将所述蛋白肽液与低聚糖进行糖基化反应，获得鱼鳞蛋白糖肽。

3、鱼鳞中的蛋白经酶解后的多肽产物组成十分复杂，其中包含大量未知序列、未知功能的多肽。而具有特定功能的活性肽如抑菌保鲜的小肽，可能包含具有不同氨基酸组成、不同分子量大小的多种肽，较难通过某些共性特征将其区分。这些都对具有特定功能的鱼鳞蛋白肽开发带来较大困难。现有技术中的鱼鳞蛋白肽并不具有抑菌保鲜的功能。

4、优选地，在本发明所提供的制备方法中，所述复合酶包括质量比为(1-2)：1的碱性蛋白酶和中性蛋白酶；所述低聚糖为海藻糖。

5、优选地，在本发明所提供的制备方法中，所述超滤分离纯化后，得到1000-2000道尔顿的蛋白肽溶液。

6、优选地，本发明所提供的制备方法中，包括：

7、(1)选用干燥并已脱灰的罗非鱼鱼鳞，加入鱼鳞重量3-6倍的水，在115-121℃的条件下煮制120-150min，将温度调整到85-90℃，利用频率为120-140kh的超声波处理10-15min，得到鱼鳞浆液；

8、(2)按照鱼鳞重量0.1-0.3％的重量百分比向鱼鳞浆液中加入复合酶，在50-60℃的条件下进行酶解反应0.5-1.0h，将温度调整到95-100℃，保持10-15min，纱布过滤，收集过滤液并将过滤液的蛋白含量调节到5-7％；

9、(3)对蛋白调整后的过滤液进行超滤，获得分子量在1000-2000道尔顿的蛋白肽溶液；再利用rp-hplc反相高效液相色谱分离纯化，通过lc-ms/ms对肽溶液的主要成分进行测定，其中氨基酸序列为pro-gly-lys-asn-gly-glu-asp-gly-glu-ser-gly的蛋白肽的含量在50％以上，优选为50-52％；

10、(4)将步骤(3)得到的蛋白肽溶液与海藻糖按照质量比为(2-4)：1，在90-100℃反应40-50min，得到鱼鳞蛋白糖肽。

11、作为本发明的一个具体实施方式，本发明提供的鱼鳞蛋白糖肽的制备方法，包括：

12、(1)选用干燥的已脱灰的罗非鱼鱼鳞，用符合饮用水卫生标准的清洁水清洗鱼鳞，清洗后加入鱼鳞重量3-6倍的水，在115-121℃的条件下煮制120-150min，将温度调整到85-90℃，利用频率为120-140kh的超声波处理10-15min，得到鱼鳞浆液。

13、(2)按照鱼鳞重量0.1-0.3％的重量百分比向鱼鳞浆液中加入质量比为1-2：1的碱性蛋白酶和中性蛋白酶，在50-60℃的条件下进行酶解反应0.5-1.0h，将温度调整到95-100℃，保持10-15分，用纱布过滤，收集过滤液，将过滤液的蛋白含量调节到5-7％。

14、(3)将步骤(2)所得的过滤液通过二步超滤方法进行处理，利用孔径为2000道尔顿的陶瓷膜超滤，先将分子量小于2000道尔顿的多肽分离出来，再用孔径为1000道尔顿的膜将分子量大于1000道尔顿的蛋白肽分离出来，

15、获得分子量为1000-2000道尔顿的蛋白肽液，蛋白肽液经过sephadex g-25凝胶分离，洗脱液为去离子水，洗脱峰在280nm下进行检测，收集第2个洗脱峰；再用rp-hplc反相高效液相色谱进行分离，反相hplc的分离条件是以5-90％乙腈溶液作为洗脱液，取16-18分收集的肽溶液；

16、通过lc-ms/ms对肽溶液的主要成分进行测定，其氨基酸序列为pro-gly-lys-asn-gly-glu-asp-gly-glu-ser-gly的蛋白肽的含量为50-52％。

17、(4)将步骤(3)得到的分子量在1000-2000道尔顿的蛋白肽溶液与海藻糖在90-100℃反应40-50min，得到鱼鳞蛋白糖肽，蛋白肽溶液：海藻糖的质量比为2-4：1。

18、(5)通过浓缩、冷冻干燥，得到糖基化鱼鳞蛋白肽粉。

19、第二方面，本发明提供一种鱼鳞蛋白糖肽，由上述的制备方法制备得到。

20、第三方面，本发明提供上述鱼鳞蛋白糖肽在制备防腐保鲜剂中的应用。

21、第四方面，本发明提供一种水产品抑菌保鲜剂，所述水产制品抑菌保鲜液含有质量分数为5-10％的上述鱼鳞蛋白糖肽的干粉。

22、第五方面，本发明提供上述鱼鳞蛋白糖肽或上述水产品抑菌保鲜液在提高冷冻鱼肉保质期、提高鱼肉抗冻性中的应用。

23、第六方面，本发明提供一种鱼肉的抑菌防腐保鲜方法，在0-4℃环境下将鱼肉中心温度预冷至4℃，将预冷后的鱼肉浸没上述的鱼鳞蛋白糖肽的溶液或上述的水产品抑菌保鲜液中，沥干，真空包装。

24、在本发明所提供的抑菌防腐保鲜方法中，预冷后的鱼肉浸没时，所述鱼鳞蛋白糖肽的溶液或水产品抑菌保鲜液的温度为0-4℃。

25、作为本发明的一个具体实施方式，一种鱼肉的抑菌防腐保鲜方法，包括：

26、(1)按照5-10％的重量百分比比例将糖基化鱼鳞蛋白肽粉溶到水中，室温200rpm搅拌10min后，0-4℃水合0.5h，获得保鲜剂；

27、(2)鲜活红鳍东方鲀剪断鱼体头部后方动脉进行放血，随后去内脏，用水漂洗后沥干，在0-4℃环境下将鱼肉中心温度预冷至4℃，将预冷的鱼浸没于0-4℃的步骤(1)得到的保鲜剂中5-20min，沥干；

28、(3)将步骤(2)得到的沥干后的鱼装入高密度聚乙烯保鲜袋中，真空包装，分别于0-4℃冷藏或-20至-23℃冻藏。

29、本发明的有益效果在于：

30、(1)本发明首次发现具有较强的抗菌、抗氧化和保水能力的鱼鳞蛋白糖肽，所述鱼鳞蛋白糖肽中含有50％以上pro-gly-lys-asn-gly-glu-asp-gly-glu-ser-gly所示的蛋白肽，将本发明得到的鱼鳞蛋白糖肽应用于冷藏鱼肉，能够显著抑制微生物生长繁殖和鱼肉氧化腐败，减少鱼肉的水分流失，具有良好的保鲜效果，可显著延长产品贮藏期。

31、(2)本发明所提供的鱼鳞蛋白肽是由多种食品级复合蛋白酶(碱性蛋白酶+中性蛋白酶)，经在温和条件下，经过适度酶解和分离获得特定功能的鱼鳞蛋白肽；利用本发明提供的鱼鳞蛋白肽和海藻糖经过低温糖基化反应，开发得到糖基化鱼蛋白肽产品。