NF2型神经纤维瘤病相关脑膜瘤永生化细胞系及其构建方法与应用

本发明实施例涉及细胞工程，具体涉及一种nf2型神经纤维瘤病相关脑膜瘤永生化细胞系及其构建方法与应用。

背景技术：

1、nf2型神经纤维瘤病(nf2-related schwannomatosis,nf2)是一种常染色体显性遗传病，因染色体22q12上的nf2基因突变引起抑癌蛋白merlin失活，造成多系统多发病变。nf2的临床表现包括双侧前庭神经鞘瘤(发病率90％-95％)、多发脑膜瘤(发病率45％-58％)、白内障(发病率60％-81％)和皮肤肿瘤(发病率59％-68％)等，其余相对少见的临床表现有脊髓室管膜瘤、周围神经病变等。由于上述病变在nf2的疾病进程中持续进展，难以通过单次手术治疗实现根治，因此亟需探索全身性治疗方案以减轻患者肿瘤负担。

2、为进一步探索nf2的治疗方案，需要准确且高效的nf2临床前模型作为揭示发病机制、疾病进展、肿瘤异质性和治疗靶点等的研究工具。临床前模型主要包括永生化细胞系、移植瘤动物模型和基因编辑动物模型等，可从多个角度验证治疗方案的疗效、毒性和不良反应。细胞系是其中常用的、相对价廉且易于操作的模型。直接提取自患者的原代细胞大多在数次传代后衰老调亡，无法满足研究需求，而通过基因转染等技术将外源性永生化基因如sv40t(sv40大t抗原)、htert(人端粒酶逆转录酶)等导入原代细胞内所建立的永生化细胞系具有无限增殖的能力，可持续提供同质性良好的研究模型。

3、目前报道的直接来源于nf2病人的细胞系仅有一株nf2前庭神经鞘瘤细胞系hei193，亟需更多的永生化细胞系以充分反映nf2的疾病表型，探索nf2的潜在治疗靶点。

技术实现思路

1、为此，本发明实施例提供一种永生化nf2型神经纤维瘤病相关脑膜瘤细胞系及其建系方法，以解决现有技术中永生化nf2原代细胞系匮乏，nf2相关研究领域受限的问题。

2、为了实现上述目的，本发明实施例提供如下技术方案：

3、根据本发明实施例的第一方面，本发明提供一种nf2型神经纤维瘤病相关脑膜瘤永生化细胞系，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为cgmcc no.45738，保藏时间为2023年10月30日。

4、根据本发明实施例的第二方面，本发明提供一种如上所述的nf2型神经纤维瘤病相关脑膜瘤永生化细胞系的构建方法，向nf2型神经纤维瘤病相关脑膜瘤原代细胞转染外源性永生化基因htert和hpv-16e6/e7，筛选阳性克隆并传代培养以获得nf2型神经纤维瘤病相关脑膜瘤永生化细胞系。

5、进一步地，所述方法包括：将nf2型神经纤维瘤病相关脑膜瘤原代细胞接种于六孔板中，使用慢病毒载体将外源性永生化基因htert和hpv-16e6/e7导入细胞中，在37℃，5％co2的培养箱中培养12h后更换新鲜培养基继续培养；连续使用一周1μg/ml的嘌呤霉素筛选感染成功的细胞，观察细胞长满后进行传代，细胞持续增殖传代至超过20代则视为永生化细胞系建立成功。

6、进一步地，所述培养基为：含有10％胎牛血清的dmem完全培养基。

7、进一步地，所述nf2型神经纤维瘤病相关脑膜瘤原代细胞的制备方法包括如下步骤：

8、1)向新鲜nf2相关脑膜瘤标本中加入消化酶，置于37℃，5％co2的培养箱中消化2-4小时；

9、2)过滤除去未被消化的碎块，收集细胞滤液，以1000rpm离心5分钟，弃上清；

10、3)向沉淀加入红细胞裂解液静置2分钟后加入10ml pbs重悬，1000rpm离心5分钟，弃上清；

11、4)向沉淀加入10ml pbs重悬，1000rpm离心5分钟，弃上清；

12、5)向沉淀加入含有10％胎牛血清的dmem完全培养基重悬，转移至培养皿中，在37℃，5％co2的培养箱中培养；

13、6)每隔48-72小时换液，对细胞进行显微镜下观察，挑选脑膜瘤细胞克隆进行扩大培养，得到nf2型神经纤维瘤病相关脑膜瘤原代细胞。

14、进一步地，所述消化酶包括木瓜蛋白酶、胰蛋白酶或胶原酶。

15、进一步地，所述过滤采用粒径为70μm或40μm的细胞滤网。

16、根据本发明实施例的第三方面，本发明提供如上所述的nf2型神经纤维瘤病相关脑膜瘤永生化细胞系的用途，所述用途选自如下任一项：

17、a.制备nf2型神经纤维瘤病相关脑膜瘤细胞或动物模型；

18、b.制备用于治疗nf2型神经纤维瘤病相关脑膜瘤的药物；

19、c.筛选nf2型神经纤维瘤病相关脑膜瘤的治疗靶点。

20、本发明实施例具有如下优点：

21、本发明通过慢病毒载体将外源性永生化基因htert和hpv-16e6/e7导入nf2相关脑膜瘤细胞中，成功构建了一株可持续增值传代的永生化nf2相关脑膜瘤细胞系，并证实了该构建方法的有效性。本发明为nf2相关领域研究提供了同质性良好、操作简便的的临床前研究模型。

技术特征：

1.一种nf2型神经纤维瘤病相关脑膜瘤永生化细胞系，其特征在于，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为cgmccno.45738，保藏时间为2023年10月30日。

2.一种如权利要求1所述的nf2型神经纤维瘤病相关脑膜瘤永生化细胞系的构建方法，其特征在于，向nf2型神经纤维瘤病相关脑膜瘤原代细胞转染外源性永生化基因htert和hpv-16e6/e7，筛选阳性克隆并传代培养以获得nf2型神经纤维瘤病相关脑膜瘤永生化细胞系。

3.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，所述方法包括：

4.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于，所述培养基为：含有10％胎牛血清的dmem完全培养基。

5.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于，所述nf2型神经纤维瘤病相关脑膜瘤原代细胞的制备方法包括如下步骤：

6.根据权利要求5所述的构建方法，其特征在于，所述消化酶包括木瓜蛋白酶、胰蛋白酶或胶原酶。

7.根据权利要求5所述的构建方法，其特征在于，所述过滤采用粒径为70μm或40μm的细胞滤网。

8.如权利要求1所述的nf2型神经纤维瘤病相关脑膜瘤永生化细胞系的用途，其特征在于，所述用途选自如下任一项：

技术总结
本发明实施例公开了一种NF2型神经纤维瘤病相关脑膜瘤永生化细胞系及其构建方法与应用。该永生化细胞系保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为CGMCC No.45738，保藏时间为2023年10月30日。本发明通过慢病毒载体将外源性永生化基因hTERT和HPV‑16E6/E7导入NF2相关脑膜瘤细胞中，成功构建了一株可持续增值传代的永生化NF2相关脑膜瘤细胞系，并证实了该构建方法的有效性。本发明为NF2相关领域研究提供了同质性良好、操作简便的的临床前研究模型。

技术研发人员：刘丕楠,王博,汪颖,严敏君
受保护的技术使用者：首都医科大学附属北京天坛医院
技术研发日：
技术公布日：2024/3/11