用于检测幽门螺旋杆菌分型与耐药突变的引物探针组、试剂盒及应用的制作方法

本发明涉及基因检测，具体涉及一种用于检测幽门螺旋杆菌分型与耐药突变的引物探针组、试剂盒及应用。

背景技术：

1、幽门螺杆菌（helicobacter pylori，h.pylori）是一种黏附于胃黏膜以及细胞间隙的革兰阴性弯曲螺杆菌，我国感染率为56%。h.pylori感染可引起消化性溃疡、胃炎等胃部疾病，约1%的感染者会发展成胃癌，其传染力很强，20%左右的感染者会有明显的临床症状，h. pylori的根除使胃癌发生率降低39%，是胃癌的一级预防措施，且用药治疗后肠道菌群的改变会恢复，因此无不良后果。

2、克拉霉素的作用机制是抗生素与细菌核糖体的亚基结合，抑制核糖体的活性，从而抑制蛋白质的合成。而幽门螺杆菌的23s核糖体rna(rrna)基因v区的点突变（a2142g/a2143g位点）可以导致核糖体构象的改变，进而改变抗生素结合位点，使得克拉霉素亲和力减弱，出现克拉霉素耐药。但除了上述两个突变外，还有研究发现了一些新的突变，这些新突变和经典突变之间的差异可能在于克拉霉素最低抑菌浓度(minimum inhibitoryconcentration, mic)不同。了解23s rrna基因相关位点的突变情况，对于评估患者的耐药情况有重要意义。

技术实现思路

1、针对上述现有技术的不足，本发明旨在提供一种用于检测幽门螺旋杆菌分型与耐药突变的引物探针组、试剂盒及应用，以实现对幽门螺杆菌分型及耐药基因突变的检查，以评估患者的耐药情况。

2、为了解决上述问题，本发明采用了如下的技术方案：

3、第一方面，本发明提供一种用于检测幽门螺旋杆菌分型与耐药突变的引物探针组，包括如seq id no.1-seq id no.7所示核酸序列的上游引物、如seq id no.8所示核酸序列的通用下游引物、如seq id no.9所示核酸序列的通用探针和如seq id no.10所示核酸序列的阻滞探针。

4、进一步，还包括如seq id no.11-seq id no.13所示核酸序列的actb内参基因引物和探针。

5、进一步，用于检测幽门螺旋杆菌分型与耐药突变的基因为23s rrna基因及其a2142g、a2143g、a2142c、a2144t、g2141a和a2115g突变型。

6、第二方面，本发明提供一种用于检测幽门螺旋杆菌分型与耐药突变的试剂盒，包括上述引物探针组。

7、进一步，包括浓度为5μm的各上游引物和通用下游引物、浓度为2.5μm的通用探针、actb内参基因探针及阻滞探针和pcr反应缓冲液。

8、第三方面，本发明提供一种用于检测幽门螺旋杆菌分型与耐药突变的系统，包括采集模块、扩增模块、荧光检测模块和数据分析模块；

9、所述采集模块用于对待测粪便样本进行待测核酸样本提取；

10、所述扩增模块用于针对23s rrna 基因及其a2142g、a2143g、a2142c、a2144t、g2141a和a2115g 突变型分别配制反应体系并进行arms-qpcr扩增，所述反应体系包括所述引物探针组；

11、所述荧光检测模块用于对arms-qpcr扩增时进行荧光检测；

12、所述数据分析模块用于对荧光检测的结果进行分析。

13、进一步，所述数据分析模块包括分型判定单元和耐药突变类型判定单元；

14、所述分型判定单元用于根据待测样本检测内参基因的joe通道ct值和检测目的基因的fam通道ct值进行幽门螺旋杆菌分型；若joe通道有信号且其ct值＜38并且fam通道ct值≥37或无扩增，则待测样本为阴性，若joe通道有信号且其ct值＜38并且fam通道有信号且ct值＜37，则待测样本为阳性；

15、所述耐药突变类型判定单元用于若待测样本为阳性，则根据fam通道ct值和joe通道ct值进行耐药突变类型判定；耐药突变类型判定包括确定fam通道ct值≤42且扩增曲线为"s"型和joe通道ct值≤38且扩增曲线为"s"型，计算fam通道ct值与joe通道ct值的差值，若该差值小于该fam通道检测突变类型的cut-offδct值，则该待测样本为阳性；若fam通道无信号、其ct值大于等于42或该差值大于等于该fam通道检测突变类型的cut-offδct值，则该待测样本为阴性。

16、进一步，所述扩增模块中arms-qpcr扩增的反应程序为：50℃、5min，ung酶消化；95℃、10min活化；95℃、15s，65℃、5s，60℃、35s，循环45次；25℃、10s，降温。

17、第四方面，本发明提供所述用于检测幽门螺旋杆菌分型与耐药突变的引物探针组或试剂盒在制备检测克拉霉素耐药基因及突变型试剂或芯片中的应用。

18、本发明的有益效果在于：本发明的引物、探针检测粪便样本23s rrna基因突变灵敏度高，可无创检测临床样本中的微量突变模板(≥0.1ng )，结果可靠，与突变检测“金标准”直接测序法的结果符合率＞95％ (为100％)。 此外该方法检测速度快，操作简单，结果判读客观，闭管反应污染少，适合于在临床中大规模开展。采用qpcr进行检测在3个工作日内即可得到检测结果，检测的敏感性好，一次检测多个样本，为提高生物临床检测水平，普及应用奠定基础。

技术特征：

1.一种用于检测幽门螺旋杆菌分型与耐药突变的引物探针组，其特征在于，包括如seqid no.1-seq id no.7所示核酸序列的上游引物、如seq id no.8所示核酸序列的通用下游引物、如seq id no.9所示核酸序列的通用探针和如seq id no.10所示核酸序列的阻滞探针。

2.根据权利要求1所示的用于检测幽门螺旋杆菌分型与耐药突变的引物探针组，其特征在于，还包括如seq id no.11-seq id no.13所示核酸序列的actb内参基因引物和探针。

3.根据权利要求1所示的用于检测幽门螺旋杆菌分型与耐药突变的引物探针组，其特征在于，用于检测幽门螺旋杆菌分型与耐药突变的基因为23s rrna 基因及其a2142g、a2143g、a2142c、a2144t、g2141a和a2115g 突变型。

4.一种用于检测幽门螺旋杆菌分型与耐药突变的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1-3任一所述的引物探针组。

5.根据权利要求4所述的用于检测幽门螺旋杆菌分型与耐药突变的试剂盒，其特征在于，包括浓度为5μm的各上游引物和通用下游引物、浓度为2.5μm的通用探针、actb内参基因探针及阻滞探针和pcr反应缓冲液。

6.一种用于检测幽门螺旋杆菌分型与耐药突变的系统，其特征在于，包括采集模块、扩增模块、荧光检测模块和数据分析模块；

7.根据权利要求6所述的用于检测幽门螺旋杆菌分型与耐药突变的系统，其特征在于，所述数据分析模块包括分型判定单元和耐药突变类型判定单元；

8.根据权利要求6所述的用于检测幽门螺旋杆菌分型与耐药突变的系统，其特征在于，所述扩增模块中arms-qpcr扩增的反应程序为：50℃、5min，ung酶消化；95℃、10min活化；95℃、15s，65℃、5s，60℃、35s，循环45次；25℃、10s，降温。

9.权利要求1-3任一所述用于检测幽门螺旋杆菌分型与耐药突变的引物探针组在制备检测克拉霉素耐药基因及突变型试剂或芯片中的应用。

10.权利要求4或5所述用于检测幽门螺旋杆菌分型与耐药突变的试剂盒在制备检测克拉霉素耐药基因及突变型试剂或芯片中的应用。

技术总结
本发明涉及基因检测技术领域，具体涉及一种用于检测幽门螺旋杆菌分型与耐药突变的引物探针组、试剂盒及应用；本发明引物探针组，包括如SEQ ID NO.1‑SEQ ID NO.7所示核酸序列的上游引物、如SEQ ID NO.8所示核酸序列的通用下游引物、如SEQ ID NO.9所示核酸序列的通用探针、如SEQ ID NO.10所示核酸序列的阻滞探针和如SEQ ID NO.11‑SEQ ID NO.13所示核酸序列的ACTB内参基因引物和探针；本发明引物探针组检测23S rRNA基因及其A2142G、A2143G、A2142C、A2144T、G2141A和A2115G突变型，灵敏度高、结果可靠、检测速度快。

技术研发人员：赵娜,王校,祁慧琳,胡长安,张亮,吴电云,胡守旺,史文钊
受保护的技术使用者：神州医疗生物科技（北京）有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/2/8