用于早期肺癌诊断的血清miRNA标志物及试剂盒的制作方法

本发明属于肺癌诊断，涉及用于早期肺癌诊断的血清mirna标志物及试剂盒。

背景技术：

1、因此早发现、早诊断和早治疗是延长肺癌患者生存期的唯一有效方法。

2、对肺癌和肺结节的评估方法通常包括临床资料、影像学、肿瘤标志物、功能显像、非手术和手术活检。年龄、职业、吸烟史、慢性肺部疾病史、个人和家族肿瘤史、治疗经过及转归等临床信息，可为肺癌和肺结节良恶性鉴别提供重要参考意见。作为早期肺癌的发现，ldct是比较经典的筛查手段，可以大大提高早期肺癌的检出率，但假阳性率高达96.4％，导致患者的过度治疗。同时辐射是这项检查的另一个弊端，因此急需要一个灵敏度和特异性均高的检测方法。

3、微小核糖核酸(microrna，mirna)是一种小的非编码单链rna，通常长度为18-25个核苷酸，可与靶基因3’utr区域结合从而对其表达进行负调控。研究表明，mirna参与调控多种生命活动，同时参与许多疾病(如：肿瘤、自身免疫性疾病等)的发生、发展及转归，因此mirna的差异表达能为疾病的筛查、诊断及预后提供临床意义。mirna的表达谱具有明显的组织特异性，在不同肿瘤中有特定的表达模式，且广泛存在于人体的各组织器官及体液内。这些特性使mirna成为肿瘤诊断的新的生物标志物和治疗靶点成为可能。qpcr是目前最常用的检测已知mirnas表达的方法，该方法快速、简单、可重复性好，能非常灵敏、准确地定量分析mirnas的表达，是临床应用中最重要的方法。这为循环mirnas作为肿瘤非侵入性诊断标志物提供了可靠的技术保障。

4、目前，尽管已经有许多研究报道了mirna在肺癌中的异常表达，并发现了许多非常有前景的肺癌早期诊断血清mirna，但这些结果并不一致，并且不能相互验证。原因在于，(1)样本类型(如：组织、血清、血浆等)、采集及保存的过程不同；(2)不同方法分离、储存及提取外周血中生物标志物的含量不同；(3)检测方法的不同，如测序法、扩增法、杂交法等；(4)个体之间的体液环境、遗传因素、生活环境等非癌因素都会影响mirna的表达，需要大量的人群样本及规范全面的入组标准来消除这种影响；(5)mirna序列较短导致引物探针设计较困难，且没有针对性的软件可以直接使用；(6)目前暂时没有标准化的内参作为参照，因此引物探针、反应体系、内参体系均需筛选及优化过程。

技术实现思路

1、基于以上，本发明的目的在于提供用于早期肺癌诊断的血清mirna标志物及试剂盒，能够将早期肺癌患者血清与健康人血清进行区分，从而快速、便捷、准确、无创地检测肺癌。

2、本发明为实现技术目的采用的技术方案为：

3、用于早期肺癌诊断的血清mirna标志物，包括hsa-mir-30d-5p_r+2、hsa-mir-101-3p、hsa-mir-124-3p、hsa-mir-137-3p、hsa-mir-190b-5p、hsa-mir-708-5p、hsa-mir-183-5p、hsa-mir-9-5p。

4、用于早期肺癌诊断的试剂盒，包括上述血清mirna标志物。

5、优选地，所述试剂盒通过logit回归方程计算风险评估值，logit回归方程为：

6、logit＝291.5+0.3234*δcthsa-mir-30d-5p_r+2+26.6579*δcthsa-mir-101-3p+8.5943*δcthsa-mir-124-3p-12.8648*δcthsa-mir

7、-137-3p-8.7368*δcthsa-mir-190b-5p-37.3647*δcthsa-mir-708-5p+1.5671*δcthsa-mir-183-5p+41.6842*δcthsa-mir-9-5p

8、根据靶点和内参(u6)的ct值，将8个靶点的ct值分别减去内参(u6)的ct值，求得8个靶点相对内参的δct，然后代入以上公式，计算出logit值。

9、更优选地，8个靶点若noct，应将ct值赋值为40(最大循环数)后，再进行计算。

10、更优选地，当样本logit＜-0.315时，则该样本为阴性，当样本logit≥-0.315时，则该样本为阳性。

11、本发明的有益效果在于：

12、本发明选择hsa-mir-30d-5p_r+2、hsa-mir-101-3p、hsa-mir-124-3p、hsa-mir-137-3p、hsa-mir-190b-5p、hsa-mir-708-5p、hsa-mir-183-5p、hsa-mir-9-5p这8个mirna作为组合分子标记物，经过临床样本验证实验，在早期肺癌诊断具有明显优势。

13、本发明首次将这8个mirna应用于早期肺癌血清mirna检测试剂盒的开发，运用实时荧光定量方法，可以实现区分早期肺癌患者和健康对照人群，从而进行临床辅助诊断，具有较高的临床应用价值。

14、本发明用于辅助诊断早期肺癌的试剂盒，可以简单、有效、无创地检测肺癌。

技术特征：

1.用于早期肺癌诊断的血清mirna标志物，包括hsa-mir-30d-5p_r+2、hsa-mir-101-3p、hsa-mir-124-3p、hsa-mir-137-3p、hsa-mir-190b-5p、hsa-mir-708-5p、hsa-mir-183-5p、hsa-mir-9-5p。

2.用于早期肺癌诊断的试剂盒，包括权利要求1所述的血清mirna标志物。

3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒通过logit回归方程计算风险评估值，logit回归方程为：

4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，8个靶点若noct，应将ct值赋值为40后，再进行计算。

5.根据权利要求3或4所述的试剂盒，其特征在于，当样本logit＜-0.315时，则该样本为阴性，当样本logit≥-0.315时，则该样本为阳性。

技术总结
本发明提供了用于早期肺癌诊断的血清miRNA标志物及试剂盒，血清miRNA标志物包括hsa‑miR‑30d‑5p_R+2、hsa‑miR‑101‑3p、hsa‑miR‑124‑3p、hsa‑miR‑137‑3p、hsa‑miR‑190b‑5p、hsa‑miR‑708‑5p、hsa‑miR‑183‑5p、hsa‑miR‑9‑5p，将其应用于早期肺癌血清miRNA检测试剂盒，可以实现区分早期肺癌患者和健康对照人群，从而进行临床辅助诊断，具有较高的临床应用价值。

技术研发人员：曹梦景,曹渊,苏畅,苏柏文
受保护的技术使用者：苏州麦锐克生物科技有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/2/29