一种基于疏水性标签载体辅助制备黑皮质素类似物环肽药物的方法

本发明涉及多肽药物制备领域，具体涉及一种基于疏水性标签载体辅助制备黑皮质素类似物环肽药物的方法。

背景技术：

1、司美诺肽是由rhythm制药公司开发的一种黑皮质素-4受体激动剂，用于治疗由原黑皮质素(pomc)、原蛋白转化酶(pcsk1)或瘦素受体(lepr)缺陷所引起的超罕见遗传性肥胖疾病。这些缺陷可能会导致嗜食症和严重的儿童期肥胖，还可能会影响其它的内分泌疾病。司美诺肽可以选择性的激动mc4r受体，是α-黑素细胞刺激激素(α-msh)的环肽类似物。外周衍生的调节激素(如瘦素)通过pomc刺激α-msh的表达，pomc通过与下丘脑的mc4r受体结合来调节饥饿、饱腹感和能量消耗。编码pomc基因突变的患者由于缺乏下丘脑msh而导致严重的过度饮食产生早发型肥胖。在pomc、pcsk1或lepr缺陷而导致mc4r受体失去激活的肥胖患者中，司美诺肽可以重新建立mc4r受体通路活性，从而降低热量摄入和增加能量消耗来减少饥饿感达到体重减轻。司美诺肽于2020年11月27日在美国批准作为一种皮下注射制剂，用于治疗6岁及以上因pomc、pcsk1或lepr缺陷导致的肥胖患者。

2、司美诺肽化学结构式如下所示：

3、

4、中国专利cn102686601a报道了使用经典液相片段缩合法制备司美诺肽，在偶联过程中重复使用氯甲酸异丁基酯，以至于缩合反应通常需要在-15℃条件下进行。因此，该方法形成酰胺键的条件比较苛刻且反应进程难监控，后处理成本比较高，不利于大规模工艺生产。在专利cn111718408a中，作者采用固相多肽合成法制备司美诺肽，该方法采用rinkamide-mbha作为树脂载体，按照司美诺肽的氨基酸序列从c端向n端依次接入相应的氨基酸得到全保护线性司美诺肽；然后，使用tfa脱除树脂载体和氨基酸侧链保护基；最后，在溶液中使用碘氧化剂氧化二硫键得到司美诺肽。所使用的树脂比较昂贵，氨基酸原料的用量是树脂用量的3～4倍，大大增加了生产成本。同时，在固相多肽合成法中后处理需要使用大量的有机溶剂进行洗涤，易造成环境污染，不利于绿色化学生产。

技术实现思路

1、基于以上现有存在的技术问题，本发明目的在于提供一种基于疏水性标签载体，以保护的his-d-phe-arg-trp为中间体片段，制备黑皮质素类似物环肽药物的方法。该方法与固相多肽合成法相比，该疏水性标签载体与氨基酸之间的摩尔比要远低于固相中树脂载体与氨基酸之间的摩尔比、溶剂使用量少、反应进程可以监控、后处理简单和生产成本低等优点，符合绿色化学生产工艺方法。

2、为实现上述技术目的，本发明采用的技术方案如下：

3、本发明提供一种基于疏水性标签载体辅助制备黑皮质素类似物环肽药物的方法，包含以下步骤：

4、步骤一，在疏水性标签tag载体上偶联fmoc-cys(trt)-cooh制备c末端连有疏水性标签保护的半胱氨酸，其结构为fmoc-cys(trt)-tag，然后脱除n端fmoc保护基，得到nh2-cys(trt)-tag；

5、步骤二，使用经典液相多肽合成法制备保护的中间体四肽片段，其氨基酸序列为：r1-his(r2)-d-phe-arg(r3)-trp-r4，r1、r2、r3和r4均为保护基。

6、步骤三，在步骤一所得nh2-cys(trt)-tag基础上，使用fmoc化学合成法依次与保护的中间体四肽片段、fmoc-d-ala-cooh、fmoc-cys(trt)-cooh和ac-arg(r3)-cooh进行偶联得到c末端连有疏水性标签载体的全保护线性司美诺肽；

7、步骤四，全保护线性司美诺肽在tfa裂解液条件下脱除c末端疏水性标签和氨基酸侧链保护基得到脱保护线性司美诺肽，进一步发生氧化环化反应得到司美诺肽粗品，经色谱纯化得到司美诺肽纯品。

8、本发明所述的一种基于疏水性标签载体辅助制备黑皮质素类似物环肽药物的方法，其特征在于，步骤一中所述采用的疏水性标签载体为双(4-二十二烷氧基苯基)甲胺，主要通过以4,4'-二(二十二烷氧基)二苯甲酮和1-溴二十二烷为原料依次经过烷基化、还原、取代和脱保护反应制得。

9、进一步地，步骤一中所述nh2-cys(trt)-tag的制备方法为：

10、(1)将疏水性标签tag载体溶解于反应溶剂中，依次加入fmoc-cys(trt)-cooh、添加剂、缩合剂和碱，在0℃条件下反应0.5～1h，移至室温继续反应，tlc监测反应终点，反应结束后，减压浓缩反应液，向残余物中加入不良溶剂析出产物，得到fmoc-cys(trt)-tag；

11、(2)将上述制备的fmoc-cys(trt)-tag溶解于反应溶剂中，加入脱fmoc保护液，tlc监测反应终点，反应结束后，减压浓缩反应液，向残余物中加入不良溶剂析出产物，得到nh2-cys(trt)-tag。

12、进一步地，所述添加剂为hobt、6-no2-hobt、6-cf3-hobt、hoat、6-cl-hobt、6-hoat、4-hoat、hodhat、hodhad、hosu、honb、hoct、hopy、hobi、hoi、6-cl-hobi、oxyma中的一种或几种；优选为hobt、hoat、hosu、honb中的一种。

13、进一步地，所述缩合剂主要为下列中的至少一种：碳二亚胺类dcc、dic、edci、cic、bmc、bec、cpc中的一种或几种；四甲基铵盐类hbtu、tbtu、tdtu、hdtu、tdatu、hdatu、tptu、hptu、tstu、hstu、tpftu、hpftu、cf3-hbtu、hatu、tatu、hattu、hott、totu、hotu、中的一种或几种；磷盐类bop、brop、pyclop、pybrop、clop、pybop、aop、pyaop、pyoxm、pynop、pyfop、pyfnbop、pyclok中的一种或几种。

14、更进一步地，缩合剂优选为dic、edci、cic、tbtu、hbtu、pybop中的一种或几种。

15、进一步地，所述碱为nmm、tea、dipea、dmap、k2co3中的一种或几种，更进一步地优选的碱为nmm、dipea中的一种。

16、进一步地，所述步骤(1)中疏水性标签tag、fmoc-cys(trt)-cooh、缩合剂、添加剂与碱摩尔比为1：1.1～3：1.1～3：1.1～3：2～8。

17、更进一步地，优选疏水性标签tag、fmoc-cys(trt)-cooh、缩合剂、添加剂与碱摩尔比为1：1.1～1.5：1.2～1.5：1.2～1.5：2.4～3。

18、进一步地，所述步骤(1)或(2)中反应溶剂为二氯甲烷、四氢呋喃、三氯甲烷中的一种或几种，优选反应溶剂为二氯甲烷或三氯甲烷；不良溶剂为甲醇、乙腈、水中的一种或几种，优选不良溶剂为甲醇或乙腈。

19、进一步地，所述步骤(2)的脱fmoc保护液为哌啶、二乙胺和dbu中的一种或几种。

20、本发明所述的一种基于疏水性标签载体辅助制备黑皮质素类似物环肽药物的方法，其特征在于，步骤二中所述保护的中间体四肽片段是采用经典液相逐一缩合法或片段缩合法偶联合成，氨基酸或肽片段的n端、c端和侧链基团均使用保护基进行保护，具体情况如下：

21、(1)n端r1所采用的保护基为ac、boc、cbz、fmoc、trt中的一种；

22、(2)his的侧链保护基r2所采用的保护基为boc、bzl、dnp、mtt、mmt、trt、tos中的一种；

23、(3)arg的侧链保护基r3所采用的保护基为alloc、boc、bzl、mtr、no2、pbf、tos中的一种；

24、(4)c端r4所采用的保护基为-ome、-otbu、-obn或h(h表示不适用保护基)中的一种。

25、进一步地，所述保护的中间体四肽片段采用经典液相逐一缩合法制成，采用保护的氨基酸原料分别为his、d-phe、arg和trp，由c端向n端依次偶联，n端使用boc为临时保护基，得到全保护的中间体四肽片段，接着分别脱除主链两端保护基，并在n端上一个fmoc保护基，得到目标保护的中间体四肽片段；或者所述保护的中间体四肽片段采用经典液相片段缩合法制成，采用保护的氨基酸原料分别为his、d-phe、arg和trp，n端使用cbz为临时保护基，先由his与d-phe偶联得到二肽中间体片段his-d-phe，由arg和trp偶联得到二肽片段arg-trp；然后使用“2+2”的片段缩合法将两个二肽片段偶联合成全保护的中间体四肽片段，接着分别脱除主链两端保护基，并在n端上一个fmoc保护基，得到目标保护的中间体四肽片段。

26、进一步地，所述全保护线性司美诺肽的制备方法为：在nh2-cys(trt)-tag基础上，重复偶联与脱保护反应，其操作流程参照合成nh2-cys(trt)-tag中的步骤(1)和步骤(2)，将nh2-cys(trt)-tag溶解于反应溶剂中，依次与保护的中间体四肽片段、fmoc-d-ala-cooh、fmoc-cys(trt)-cooh和ac-arg(r3)-cooh进行偶联。所述保护的中间体四肽片段记为fmoc保护的片段，fmoc-d-ala-cooh、fmoc-cys(trt)-cooh和ac-arg(r3)-cooh都记为fmoc保护的氨基酸。

27、进一步地，全保护线性司美诺肽制备的偶联反应过程中，nh2-cys(trt)-tag、fmoc保护的氨基酸或片段、缩合剂、添加剂与碱摩尔比依次为1：1.1～3：1.1～3：1.1～3：2～8。

28、更进一步地，优选nh2-cys(trt)-tag、fmoc保护的氨基酸或片段、缩合剂、添加剂与碱摩尔比依次为1：1.1～1.5：1.2～1.5：1.2～1.5：2.4～3。

29、进一步地，所述脱除c末端疏水性标签和氨基酸侧链保护基的方法为：向反应体系中加入tfa裂解液，在室温下反应2～5h，反应结束后浓缩反应液，向体系加入不良溶剂析晶，抽滤，洗涤得到线性肽粗品。所述的裂解液种类为三氟乙酸、2,2'-(1,2-乙二基双氧代)双乙硫醇、三异丙基硅烷和水的混合溶液，其中体积比为87～95：2～5：2～5：2～5，优选体积比为90～95：2～3：2～3：2～3。所述的不良溶剂为乙醚、甲基叔丁基醚、异丙醚中的一种或几种，优选为甲基叔丁基醚或异丙醚。

30、进一步地，所述第四步中，脱保护线性司美诺肽通过氧化剂氧化形成分子内二硫键得到司美诺肽粗品，其中氧化剂为空气氧化、i2、h2o2、dmso中一种或几种，优选为h2o2。

31、与现有技术相比，本发明的有益效果是：我们采用了一种基于疏水性标签载体为辅助，以保护的his-d-phe-arg-trp为中间体片段，制备黑皮质素类似物环肽药物的方法，一方面使用经典液相合成法合成保护的his-d-phe-arg-trp中间体片段，可以通过重结晶操作进行纯化，避免多次使用以fmoc保护的氨基酸，使其原子经济性更高，降低生产成本；另一方面使用片段缩合的方式进行偶联，避免由于多次脱fmoc保护基而引入杂质，使其更加的高效性和可控性；在偶联与脱保护反应中，我们使用双(4-二十二烷氧基苯基)甲胺疏水性标签代替固相合成中的树脂载体，使其氨基酸和缩合剂的投料量减少，反应均相，后处理仅需加入甲醇或乙腈即可析出产物并洗涤，相较于固相中使用n,n-二甲基甲酰胺和n-甲基吡咯烷酮，用量少且绿色环保。在二硫键环合反应中，我们发现使用h2o2作氧化剂要优于碘，同时可以避免肽序列中的色氨酸(trp)和组氨酸(his)发生氧化而产生副产物。