抗狂犬病毒N蛋白单克隆抗体、质粒载体组合及制备方法与流程

本发明属于生物工程。具体来说，本发明涉及一种新的重组蛋白，涉及使用上述重组蛋白免疫小鼠建立噬菌体库，筛选得到特异性单链抗体scfv序列，还涉及将得到的scfv序列构建成真核表达载体表达抗狂犬病毒n蛋白单克隆抗体，并应用于狂犬病毒n蛋白抗原检测。

背景技术：

1、狂犬病毒(rabies virus,rv)属于弹状病毒科(rhabdoviridae)狂犬病毒属(lyssavirus)。外形呈弹状，核衣壳呈螺旋对称，表面具有包膜，内含有单链rna，是引起狂犬病的病原体。狂犬病毒含5种蛋白，即糖蛋白(g)、核蛋白(n)、聚合酶(l)、磷蛋白(p)及基质(m)等。n蛋白包裹病毒基因组，构成核蛋白，核蛋白又与p和l蛋白相互作用形成病毒核衣壳。n蛋白是狂犬病病毒的主要抗原，刺激机体诱生相应抗体和细胞免疫。

2、狂犬病毒主要存在于患病动物的延脑、大脑皮层、小脑和脊髓中。唾液腺和唾液中也常含有大量病毒，被患狂犬病的动物咬伤、抓伤或经粘膜感染均可引起狂犬病，在特定条件下也可以通过呼吸道气溶胶传染。狂犬病潜伏期通常为2～3个月，短则不到一周，长则一年，这取决于狂犬病毒入口位置和狂犬病毒载量等因素。狂犬病毒侵入机体后，先在被咬伤的肌肉组织中复制，然后通过运动神经元的终板和轴突侵入外周神经系统，进而向中枢神经系统“向心性”移动，最后到达中枢神经系统后迅速增殖，再通过神经扩散到唾液腺，然后又由疯动物的唾液污染其他动物的伤口或粘膜传染给下一个宿主。狂犬病病毒会攻击哺乳类动物的神经系统，一旦开始出现症状，对于人类或动物几乎是100％致命的。预防狂犬病唯一有效的办法是及时接种狂犬病疫苗，同时加强检测疫苗免疫效果。

3、因此需要制备狂犬病毒n蛋白单克隆抗体，用于狂犬病毒特异性识别和检测。常规狂犬病毒n蛋白单克隆抗体制备是将狂犬病毒n蛋白单克隆细胞株制备balb/c小鼠腹水，使用protein a亲和层析法纯化单克隆抗体。但由于单只小鼠腹水产量不确定性且个体差异大，得到的抗狂犬病毒n蛋白单克隆抗体批间差异大，使得检测准确性较差。

技术实现思路

1、设计目的：为解决传统小鼠腹水制备单克隆抗体周期长、纯度低、批间差异大的不足，通过设计、合成狂犬病毒n蛋白并通过建立噬菌体库和真核细胞表达来制备其单克隆抗体，不仅节省时间，而且能降低批间差异，提高检测准确性。

2、设计方案：为了实现上述设计目的。本技术：(1)以狂犬病毒n蛋白为靶抗原，分析并选择该抗原的两个特异性优势抗原表位，序列比对结果显示所选择的两个抗原表位与其它蛋白序列无明显同源性。(2)为了促进所选择优势抗原表位对balb/c小鼠免疫系统的刺激，增强免疫效果，将所选择的两个优势抗原表位序列通过柔性片段串联形成重组蛋白氨基酸序列。(3)采用大肠杆菌偏爱密码子，将重组蛋白氨基酸序列转换为对应的核苷酸序列，以利于重组蛋白在大肠杆菌中的高效表达。(4)化学合成上一步骤得到的核苷酸序列，并通过酶切连接，将合成得到的核苷酸片段插入原核表达载体pet-32a，构建重组蛋白表达载体。(5)重组蛋白表达载体转化大肠杆菌er2566感受态细胞，加氨苄青霉素抗性筛选培养基筛选得到重组蛋白表达菌株。(6)重组蛋白表达菌株大规模培养后，超声破菌并低温离心，取溶液上清通过镍琼脂糖亲和层析柱亲和层析，洗脱得到纯化重组蛋白。(7)纯化的重组蛋白多次免疫balb/c小鼠后，取其脾脏分离淋巴细胞用来建立单链抗体scfv噬菌体展示库，使用抗狂犬病毒n蛋白进行多轮淘选筛选最终得到能与重组狂犬病毒n蛋白结合的单链抗体scfv序列。(8)将scfv序列构建成完整鼠igg1表达载体并使用hek293细胞表达单克隆抗体，使用protein a亲和层析纯化单克隆抗体，并分别标记铕离子(eu3+)。(9)正交实验筛选显示21d2单抗包被与17f4标记单抗配对检测狂犬病毒n蛋白为最佳组合。

3、具体实施方案：以下实施例虽然对本发明的设计思路做了比较详细的文字描述，但是这些文字描述，只是对本发明设计思路的简单文字描述，而不是对本发明设计思路的限制，任何不超出本发明设计思路的组合、增加或修改，均落入到本发明的保护范围内。

4、实施例1：狂犬病毒n蛋白优势抗原表位选择

5、以狂犬病毒n蛋白为靶抗原，利用生物软件dnassist2.0分析其抗原表位序列的亲水性及抗原性，选择a优势抗原表位和b优势抗原表位。同时，序列比较结果表明所选择的a、b两个优势抗原表位序列特异性高，与其它蛋白序列无明显同源性。

6、实施例2：狂犬病毒n蛋白优势抗原表位串联

7、为增强所选择抗原表位对小鼠免疫系统的刺激以利于后续实验的进行，将狂犬病毒n蛋白的a、b两个优势抗原表位序列分别重复再通过柔性片段(连续4个甘氨酸)连接，得到重组蛋白氨基酸序列。

8、实施例3：优化编码重组蛋白的核苷酸序列

9、为提高重组蛋白在大肠杆菌中的表达量，在重组蛋白氨基酸序列不变的前提下，根据大肠杆菌偏爱密码子将编码重组蛋白的氨基酸序列转化为对应的核苷酸序列，并在其上下游分别添加酶切位点bamhi和ecori对应的核苷酸序列，由苏州金唯智生物科技有限公司合成。合成后的目的基因克隆于pmd19-t载体(宝生物工程大连有限公司)中。

10、实施例4：构建重组蛋白表达载体

11、用限制性内切酶bamhi和ecori(宝生物工程大连有限公司)于37℃分别双酶切含目的基因的pmd19-t载体和pet-32a载体(德国novagen公司)12小时，酶切产物分别行1％琼脂糖凝胶电泳，并分别切胶回收目的基因和pet-32a载体(本发明所使用的胶回收试剂盒均购自宁波中鼎生物技术有限公司)。使用t4连接酶(宝生物工程大连有限公司)将回收的目的基因和pet-32a载体按一定比例于4℃连接12小时后，连接产物转化dh5α感受态细胞(杭州贤至生物科技有限公司)，并涂布于含氨苄青霉素抗性(50μg/ml)的lb平板上，于37℃恒温培养12小时后，于平板上挑取单克隆菌株至含氨苄青霉素抗性(50μg/ml)的lb液体培养基，37℃恒温摇床培养12小时后，采用质粒纯化试剂盒(本发明所使用的质粒纯化试剂盒均购于宁波中鼎生物技术有限公司)提取质粒，经bamhi和ecori双酶切鉴定后得到正确的重组表达载体。

12、实施例5：构建重组狂犬病毒n蛋白表达菌株

13、将构建好的重组表达载体转化e.coli er2566感受态细胞，并涂布于含氨苄青霉素抗性(50μg/ml)的lb平板上，于37℃过夜培养。次日挑取平板上单克隆菌株至含氨苄青霉素抗性(50μg/ml)的lb液体培养基，37℃恒温摇床培养8小时后，取1ml保存，剩余加诱导剂iptg(异丙基硫代-β-d-半乳糖苷)(终浓度为1.0mmol/l)诱导表达4小时后制备蛋白电泳样品。11％聚丙烯酰胺凝胶电泳结果表明重组蛋白成功表达，得到重组狂犬病毒n蛋白表达菌株。

14、实施例6：纯化重组狂犬病毒n蛋白

15、接种重组蛋白表达菌株至lb液体培养基，加氨苄青霉素至终浓度为50μg/ml，37℃恒温摇床培养8小时后，用含50μg/ml氨苄青霉素的lb液体培养基将该菌按1：100比例稀释后，分装至细菌培养瓶，置37℃恒温摇床培养至od600＝0.8，加诱导剂iptg(异丙基硫代-β-d-半乳糖苷)至终浓度为1.0mmol/l，继续培养诱导4小时。离心收集菌体后，4度低温超声破菌，低温离心后取上清通过镍琼脂糖亲和层析柱，经洗涤、洗脱最终得到纯化重组狂犬病毒n蛋白。

16、实施例7：单链抗体scfv噬菌体库构建

17、取4-6周龄雌性balb/c小鼠，基础免疫每只小鼠皮下多点注射弗氏完全佐剂乳化的100μg重组狂犬病毒n蛋白，共400μl/只。20天后进行第二次加强免疫，方法为取80μg重组狂犬病毒n蛋白用弗氏不完全佐剂乳化，共400μl/只，皮下多点注射。第三次加强免疫在15天以后，方法与第二次加强免疫相同。20天后，取120μg重组狂犬病毒n蛋白腹腔加强注射，于72小时后，眼眶取血，并处死小鼠，取其脾脏用鼠脾脏淋巴细胞分离试剂盒(天津市灏洋生物制品科技有限责任公司)分离鼠脾脏淋巴细胞。用rna提取试剂盒(天根生化科技有限公司)从分离的淋巴细胞中提取总rna，用反转录试剂盒(takara)反转录合成cdna，用鼠源单链抗体scfv通用简并引物扩增重链可变区以及轻链可变区基因，pcr产物分别进行1％琼脂糖凝胶电泳，并分别切胶回收目的基因，回收的目的基因通过overlap pcr链接成scfv，pcr产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，并且胶回收目的基因经noti和sfii酶切后使用t4连接酶和pcantab5e(北京宝科维食安生物技术有限公司)载体按一定比例于4℃连接12小时后，连接产物经胶回收试剂盒回收以去除里面的酶及缓冲物质，回收产物用细菌电转化仪(biorad)分多次电转入大肠杆菌tg1电转感受态，并涂布于含氨苄青霉素抗性(50μg/ml)及2％葡萄糖的2×yt-ag平板，于30℃恒温培养12小时之后，取适量的2×yt培养基用无菌玻璃棒将平板上的菌落全部刮取下来并收集菌体悬液，此为构建好的噬菌体抗体库。

18、实施例8：单链抗体scfv的淘选及筛选

19、从噬菌体抗体库中取一定量的菌液接种到2×yt-ag培养液中使od600为0.3。37℃，250rpm振荡1h左右，使od600达0.5后加入辅助噬菌体m13k07超感染，感染比例为m13k07/tg1＝20:1。37℃，250rpm振荡1h后3300g，4℃离心10min沉淀细菌，小心移弃上清。重悬细菌到含氨苄青霉素抗性(50μg/ml)及氨苄青霉素抗性(50μg/ml)的2×yt-ak培养基中，30℃，250rpm振荡培养过夜。次日，10800g，4℃离心20min沉淀细菌。上清移入干净离心管中，加入1/5体积的peg/nacl，混合后冰浴2h。10800g，4℃离心20min沉淀细胞，小心移弃上清，扣干，将沉淀重悬于pbs中，用0.45μm膜过滤去除细菌碎片用于淘选步骤。将纯化的重组狂犬病毒n蛋白抗原用包被液稀释至8μg/ml包被免疫管(thermo)，每个免疫管4ml，4℃过夜包被。次日，弃去包被液和未吸附的抗原，无菌pbst洗涤3次，每个免疫管加入封闭液5ml，37℃孵育2h。弃去封闭液，无菌pbst洗涤3次后将经peg沉淀获得的噬菌体加入免疫管中，每个免疫管加入4ml，37℃孵育1h。弃去免疫管中的液体，用无菌pbst洗涤10次再用无菌pbs洗涤10次后加入1ml 100mm三乙胺将结合的噬菌体洗脱下来，再立即加入500μl 1m tris-hcl，ph 7.4进行中和。将中和后的噬菌体加入一定量处于对数生长期的tg1大肠杆菌中进行超感染，此为第一轮淘选富集过程。经过3轮淘选，狂犬病毒n重组蛋白特异性scfv得以富集。将最后一轮洗脱中和后的噬菌体侵染tg1大肠杆菌后涂布于2×yt-ag平板上，于30℃恒温培养12小时之后随机挑取400—600个单克隆菌落于96孔深孔板中，用2×yt-ag培养基37℃，250rpm振荡2h后加入一定量m13k07辅助噬菌体进行超感染，37℃，250rpm振荡1h后离心去掉上清加入含氨苄青霉素抗性(50μg/ml)及氨苄青霉素抗性(50μg/ml)的2×yt-ak培养基30℃，250rpm过夜培养。第二天进行单克隆elisa筛选，筛选步骤如下：

20、包被：用包被液稀释重组狂犬病毒n重组蛋白至终浓度为1μg/ml，100μl/

21、孔加入酶标板(深圳金灿华实业有限公司)，4℃过夜后通过dem-3型洗板机(中山大学达安基因股份有限公司)用洗涤液洗涤1次；

22、封闭：以200μl/孔加入封闭液，37℃封闭2h，通过洗板机用洗涤液洗涤1次；

23、加样：加过夜诱导表达的细菌培养上清及对照血清，100μl/孔，37℃孵育1h，通过洗板机用洗涤液洗涤3次；

24、加酶标抗体：以100μl/孔加入新鲜稀释兔抗m13噬菌体hrp酶标二抗(购自北京义翘神州生物技术有限公司)，37℃孵育30分钟后，通过洗板机用洗涤液洗涤4次；

25、加显色液：每孔加显色液a和显色液b各50μl，37℃避光显色10分钟；

26、终止反应：以50μl/孔加入2m h2so4；

27、结果判定：在酶标仪上，于450nm处，空白孔校零后读取od值。以免疫小鼠血清作为阳性对照。结果显示有14个阳性克隆od值较高，经测序得到5株scfv序列，分别为12b7、15a9、14h6、21d2、17f4。相关溶液配方如下：

28、包被液：na2co3 1.5g，nahco3 2.9g，加ddh2o定容至1000ml(ph9.6)。

29、封闭液：na2hpo4·12h2o 2.68g，nah2po4·2h2o 0.39g，nacl 8.5g，20g牛血清白蛋白，加ddh2o定容至1000ml(ph7.4)。

30、洗涤液：na2hpo4·12h2o 2.68g，nah2po4·2h2o 0.39g，nacl 8.5g，tween-200.5ml，加ddh2o定容至1000ml(ph7.4)。

31、显色液a：200mg tmb溶于100ml无水乙醇，加ddh2o定容至1000ml。

32、显色液b：柠檬酸2.1g，na2hpo4·12h2o 71g，加ddh2o定容至1000ml。

33、使用时：1ml显色液a+1ml显色液b+0.4μl 30％ h2o2

34、终止液：2m h2so4，21.7ml浓h2so4加ddh2o定容至1000ml。

35、实施例9：真核表达载体构建及hek293f细胞瞬转表达和纯化

36、将5株狂犬病毒n蛋白抗体scfv序列分别构建成完整鼠igg1抗体序列，即将scfv中重链可变区与轻链可变区通过pcr分别与鼠igg1重链恒定区和轻链恒定区桥接，再分别插入到pcdna3.1(德国novagen公司)质粒中。分别通过pei将构建好的重链质粒与轻链质粒共转染hek293f细胞，37℃，5％二氧化碳，120rpm细胞摇床表达7天后离心沉淀，收集上清过0.45μm滤器。用50ml平衡缓冲液pbs(ph7.4)平衡琼脂糖亲和介质protein a层析柱(南京金斯瑞生物科技有限公司)至电脑核酸蛋白检测仪(上海沪西分析仪器厂有限公司)显示吸光度为0。上清上样后加pbs洗涤至吸光度为0，然后用0.1m甘氨酸(ph3.0)洗脱，收集流出液并加入500mm tris-hcl(ph8.5)缓冲液中和至ph 7.0左右，得到纯化的单克隆抗体12b7、15a9、14h6、21d2、17f4。

37、实施例10：eu3+标记单抗的制备

38、取1mg纯化后的单克隆抗体于0.05mol/l碳酸盐缓冲液(ph9.6)中4℃透析3次，加入1mg dtpa(二乙基三胺五乙酸)立即混匀，室温反应1h，加入200μl eucl3(33mmol/l)，室温反应1h后用10m mol/l pbs(ph7.4)于4℃过夜透析。以上述方法分别对单抗12b7、15a9、14h6、21d2、17f4进行eu3+标记。相关溶液配方如下：

39、碳酸盐缓冲液(ph9.6)：na2co3 1.5g，nahco3 2.9g，加双蒸水定容至1000ml。pbs缓冲液(ph7.4)：kh2po4 0.29g，na2hpo4·12h2o 2.9g，nacl 8.2g，加双蒸水定容到1000ml。

40、实施例11：配对单抗筛选

41、5株单克隆抗体(12b7、15a9、14h6、21d2、17f4)分别经包被液稀释后(终浓度为1μg/ml)，以100μl/孔加入酶标板(无锡国盛生物工程有限公司)，4℃包被12小时后通过dem-3型洗板机(中山大学达安基因股份有限公司)用洗涤液洗涤2次；加入封闭液，150μl/孔，37℃封闭1小时，洗板机洗板1次；加狂犬病毒灭活阳性样本与阴性样本，100μl/孔，室温震荡孵育30分钟后，洗涤液洗涤5次；加实施例10制备得到的eu3+标记单抗，100μl/孔，室温震荡孵育30分钟后，洗涤液洗涤5次；增强液100μl/孔，室温震荡5分钟，置于时间分辨检测仪(上海新波生物技术有限公司)读值。相关溶液配方如下：

42、包被液：na2co31.5g，nahco3 2.9g，加双蒸水定容至1000ml(ph9.6)。

43、封闭液：na2hpo4.12h2o 2.68g，nah2po4.2h2o 0.39g，nacl 8.5g，20g牛血清白蛋白，加双蒸水定容至1000ml(ph7.4)。

44、洗涤液：na2hpo4.12h2o 2.68g，nah2po4.2h2o 0.39g，nacl 8.5g，tween-200.5ml，加双蒸水定容至1000ml(ph7.4)。

45、增强液：冰醋酸6ml，triton x-100 1ml，topo(tri-octyl phosphine oxide正三辛基氧膦)50μmol，β-nta(n(ch2cooh)3氨三乙酸)15μmol，用0.1mol/l的邻苯二甲酸氢钾调ph至3.2，加双蒸水定容至1000ml。

46、以上述方法正交检测各包被单抗与铕标单抗配对，求p/n值(阳性标本检测均值与阴性标本检测均值比值)，见表1。

47、

48、通过上表可知，21d2单抗包被与17f4配对检测狂犬病毒n蛋白为最佳组合。