一种检测缺失型地中海贫血的引物组、方法及其应用与流程

本发明涉及基因检测领域，具体涉及一种基于多重gap-pcr技术检测中国常见缺失型地中海贫血的引物组、方法及其应用。

背景技术：

1、地中海贫血(thalassemia)，简称地中海贫血，是遗传性溶血性贫血，是由于基因缺陷致使血红蛋白中一种或几种珠蛋白链合成缺失或不足而导致的贫血或病理状态；是世界上最常见的单基因遗传病之一，主要分布在包括我国南方在内的世界上热带和亚热带疟疾高发地区；其中α-地中海贫血、β-地中海贫血是最常见的地中海贫血类型。

2、α-地中海贫血是由于α珠蛋白表达减少或完全缺失导致的突变类型；其编码基因——α珠蛋白基因簇定位于16号染色体16p13.3；正常人群有4个α珠蛋白基因，当一个或多个α珠蛋白基因变异或缺失就会导致α-地中海贫血。α2和α1基因的表达分别占整个α-珠蛋白产量的2/3和1/3，因此α2基因缺陷比α1基因缺陷具有更严重的影响。α-地中海贫血突变分为缺失型与非缺失型，常见的缺失型突变包括--sea、-α3.7、-α4.2和--thai；非缺失型突变包括hba2：c.369c>g(hbws)、hba2：c.427t>c(hb cs)和hba2：c.377t>c(hb qs)；其中，缺失型突变频率高于非缺失型突变频率。α-地中海贫血属于世界范围内高发的单基因遗传病，其致病携带率约占世界人口的5％；中国人群中主要发生于长江以南地区。

3、β-地中海贫血是一种常染色体隐性遗传病，主要由β珠蛋白基因hbb缺陷所致，该基因位于11号染色体末端11p15.3位点，其发病机制由于β球蛋白肽链合成减少或缺失，使rbc的主要结构蛋白-hb生成障碍，导致无效造血和rbc破坏而产生溶血性贫血。目前在中国人群中已发现129种β-地中海贫血点突变和16种β-地中海贫血缺失突变，其中hbb:c.124_127delttct、hbb:52a>t、hbb:c.316-197c>t、hbb:c.-78a>g、hbb:c.216_217insa、hbb:79g>a、hbb:c.92+1g>t、hbb:c.79a>g共8种点突变约占中国人群β-地中海贫血突变总体的95％以上；中国型gγ+(aγδβ)0缺失是目前中国人群中常见的β-缺失型地中海贫血。β-地中海贫血在我国的广西、广东及海南省三个地区发病率最高，其人群中的基因携带率为2％-30％，其中重型β-地中海贫血的发生率达0.4％。

4、α-地中海贫血和β-地中海贫血目前都存在无法完全治愈或者需要高昂的治疗费用，并不适用所有人群；因此α-地中海贫血和β-地中海贫血作为中国人群中常见的遗传病，筛查仍然是预防或评估患病风险的重要途径。

5、目前针对缺失型α-地中海贫血和缺失型β-地中海贫血的分子检测技术包括检测缺失型突变的southern印迹、gap-pcr、多重连接探针扩增(multiplexligation dependentprobe amplification，mlpa)和微阵列比较基因组杂交(comparative genomichybridization，array-cgh)与检测非缺失型突变的反向点杂交(reverse dot blothybridization，rdb)、基于实时pcr的荧光标记探针的熔解曲线法(pcr melting curveanalysis，pmca)和ngs、tgs高通量测序。其中，southern印迹是最经典的技术方法，但已极少使用；mlpa、array-cgh、ngs、tgs均存在成本高，技术复杂，检测周期长等局限性。

6、cn108796054a 20181113公开了一种同时检测α地贫缺失型–α3.7、–α4.2、--sea、--thai，以及β缺失型sea-hpfh、中国型、中国台湾型的缺失型检测引物，cn102181560a20110914和cn104212910a 20141217都是同时检测了一些并非常见的缺失，耗时耗力。

7、地中海贫血作为常见的罕见病在我国携带者频率较高，增加了新生儿患病的风险；本发明结合2020年《α地中海贫血临床实践指南》、《β地中海贫血临床实践指南》、《地中海贫血妊娠期管理专家共识》以及国家eqa文件筛选出符合我国人群特点的5种缺失型地中海贫血变异可以为临床提供快速、准确且更加全面的指导依据，预防重型地中海贫血新生儿的出生，提供一次性快速、简单、成本低、易于全面推广筛查地检测中国人常见的缺失型地中海贫血的引物组、筛查方法及其应用。

技术实现思路

1、本发明提供了一种检测缺失型地中海贫血的引物组，所述引物组序列包括多重扩增引物序列，分成2组，第一组扩增引物序列包括如seq_id no.1-3所示的序列，第二组扩增引物序列包括如seq_id no.4-12所示的序列。

2、本发明还提供了一种检测缺失型地中海贫血的组合物，所述的组合物包括如seq_id no.1-3所示的序列如seq_id no.4-12所示的序列。

3、本发明还提供了一种检测缺失型地中海贫血的试剂盒，所述引物组序列包括如seq_id no.1-3所示的序列如seq_id no.4-12所示的序列。

4、本发明还提供了一种检测缺失型地中海贫血的方法，所述方法包括应用所述的引物组对待测样品基因组中5种缺失型变异进行检测。

5、本发明还提供了一种如权利要求1所述的引物组在制备筛查缺失型地中海贫血产品中的应用，应用用于筛查5种缺失型地中海贫血的引物组对待测对象基因组进行多重gap-pcr扩增，再通过琼脂糖凝胶电泳对pcr产物进行鉴定，确定所述待测对象基因组中是否存在上述5种缺失型地中海贫血变异。

6、本发明还提供了一种如权利要求1所述的引物组在核酸质谱检测中的应用。本发明的有益效果是：一种检测缺失型地中海贫血的引物组、方法及其应用，能够对--sea、-α3.7、-α4.2和--thai以及中国型gγ+(aγδβ)0突变位点实现特异性检测，根据2020年《α地中海贫血临床实践指南》、《β地中海贫血临床实践指南》、《地中海贫血妊娠期管理专家共识》以及国家eqa文件中建议筛查的地中海贫血长片段缺失型变异位点，更符合我国的人群特点；具有准确性强、灵敏度高、重复性好以及成本低、检测周期短且结果直观无需生物信息学技术的介入等优势；克服了现有技术中一次性检测缺失型地中海贫血位点较少的缺陷，适用于广泛推广；本发明所需样本的适应性强，对外周血和全基因组扩增产物均能较好的检出；适用于婴幼儿以及需要生育者，可以帮助有疑似家族史的受检者筛查致病缺失，评估致病效力，辅助再生殖；高风险携带者可及早采取针对性措施，提升治疗效果，降低新生儿患病风险，为缺失型地中海贫血的防治提供有效的科学依据。

技术特征：

1.一种检测缺失型地中海贫血的引物组，其特征在于：所述引物组序列包括多重扩增引物序列，分成2组，第一组扩增引物序列包括如seq_id no.1-3所示的序列，第二组扩增引物序列包括如seq_id no.4-12所示的序列。

2.一种检测缺失型地中海贫血的组合物，其特征在于：所述的组合物包括如seq_idno.1-3所示的序列如seq_id no.4-12所示的序列。

3.一种检测缺失型地中海贫血的试剂盒，其特征在于：所述引物组序列包括如seq_idno.1-3所示的序列如seq_id no.4-12所示的序列。

4.一种检测缺失型地中海贫血的方法，所述方法包括应用如权利要求1所述的引物组对待测样品基因组中5种缺失型变异进行检测。

5.一种如权利要求1所述的引物组在制备筛查缺失型地中海贫血产品中的应用。

6.根据权利要求2所述的如权利要求1所述的引物组在制备筛查缺失型地中海贫血产品中的应用，其特征在于：应用用于筛查5种缺失型地中海贫血的如权利要求1所述的引物组对待测对象基因组进行多重gap-pcr扩增，再通过琼脂糖凝胶电泳对pcr产物进行鉴定，确定所述待测对象基因组中是否存在上述5种缺失型地中海贫血变异。

7.一种如权利要求1所述的引物组在核酸质谱检测中的应用。

技术总结
本发明的目的在于提供一种检测中国常见缺失型地中海贫血的引物组、方法及其应用，能够对‑‑<supgt;SEA</supgt;、‑α<supgt;3.7</supgt;、‑α<supgt;4.2</supgt;和‑‑<supgt;THAI</supgt;以及中国型<supgt;G</supgt;γ<supgt;+</supgt;(<supgt;A</supgt;γδβ)<supgt;0</supgt;突变位点实现特异性检测，具有准确性强、灵敏度高、重复性好以及成本低、检测周期短且结果直观无需生物信息学技术的介入等优势；克服了现有技术中一次性检测缺失型地中海贫血位点较少的缺陷，适用于广泛推广；本发明所需样本的适应性强，对外周血和全基因组扩增产物均能较好的检出；适用于婴幼儿以及需要生育者，可以帮助有疑似家族史的受检者筛查致病缺失，评估致病效力，辅助再生殖；高风险携带者可及早采取针对性措施，提升治疗效果，降低新生儿患病风险，为缺失型地中海贫血的防治提供有效的科学依据。

技术研发人员：耿娟,郑昭璟,陈碧霄,陈秀霞,梁丹军,许焱婷,叶幸
受保护的技术使用者：杭州金诺医学检验实验室有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/3/11