一种用于检测水稻转化事件L216-44-2的引物对及其应用的制作方法

本发明涉及生物工程，尤其涉及一种用于检测水稻转化事件l216-44-2的引物对及其应用。

背景技术：

1、转基因作物，例如大豆、玉米、棉花和油菜等转基因作物等已在广泛范围内种植和生产，其可以加工成食品、饲料或食品添加剂等多种产品，但是目前转基因产品的生态安全和食用安全仍备受争议，仍需要严格的监管。生物安全评价是转基因产品监管中的重要环节，其中较为关键的流程是根据插入位点判断宿主基因组插入失活或缺失的情况，进一步推测该转化事件对宿主的影响和可能导致的安全性问题。

2、作为建立转基因植物品系特异性检测方法的重要技术资料，转基因事件中的插入位点侧翼序列时区别不同转化事件的唯一性标识，这是因为外源插入片段在宿主植物基因组中的整合位置随机，每个外源插入片段左右端序列与宿主基因组序列拼接而成的插入位点侧翼序列是唯一的。转化事件的特异性检测具有高度特异性，可准确识别不同的转基因作物品系。目前分离外源插入片段的侧翼序列主要以pcr技术为基础，建立的特异性检测方法包括反向pcr、外源接头介导pcr、半随机引物pcr、全基因组重测序技术等，其中半随机引物pcr中的热不对称交错pcr(tail-pcr)、高效热不对称pcr(hitail-pcr)或染色体步移法(genome walking)是当前常见的使用方法。

技术实现思路

1、为了解决现有技术存在的问题，本发明提供一种用于检测水稻转化事件l216-44-2的引物对及其应用。

2、针对已获得的具遗传稳定性且农艺性状优良的草甘膦抗性的水稻转化事件l216-44-2，本发明明确了草甘膦抗性的水稻转化事件l216-44-2的分子特征、推进了l216-44-2的生物安全性评价工作。具体地，本发明以l216-44-2的t0代植株的dna为模板，利用hitail-pcr分离其t-dna侧翼序列，并根据t-dna左右端序列和左右侧翼序列设计检测引物，建立了特异性检测草甘膦抗性的水稻转化事件l216-44-2的方法，同时检验该方法的特异性与灵敏度，为草甘膦抗性的水稻转化事件l216-44-2及其衍生产品的检测和身份识别提供技术依据。

3、第一方面，本发明提供一种用于检测水稻转化事件l216-44-2的引物对，包括：

4、如seq id no.11-12所示的核苷酸序列和如seq id no.9-10所示的核苷酸序列。

5、本发明进一步提供一种试剂盒，包括所述的引物对。

6、进一步地，所述试剂盒还包括水、taq dna聚合酶、dntps、pcr缓冲液、阳性对照品和阴性对照品。

7、本发明进一步提供草甘膦抗性的水稻转化事件l216-44-2外源插入载体的侧翼序列，所述侧翼序列右侧翼序列如seq id no.1所示；所述侧翼序列的左侧翼序列如seq idno.2所示。

8、进一步地，所述侧翼序列分别由如seq id no.11-12所示的核苷酸序列和如seqid no.9-10所示的核苷酸序列扩增得到。

9、具体地，右侧翼序列共732个碱基，其中第1至149个碱基来源于水稻基因组第1号染色体，右侧翼序列的第150至732个碱基来源于l216载体序列，右侧翼序列是草甘膦抗性的水稻转化事件l216-44-2的外源插入载体5’端边界侧翼序列；

10、左侧翼序列共792个碱基，其中第1至644个碱基来源于水稻基因组第1号染色体，左侧翼序列的第645至792个碱基来源于l216载体，左侧翼序列是草甘膦抗性的水稻转化事件l216-44-2的外源插入载体3’端边界侧翼序列。

11、上述右翼及左翼序列是草甘膦抗性的水稻转化事件l216-44-2的特征序列，可用于区分草甘膦抗性的水稻转化事件l216-44-2与其他转基因/非转基因水稻，以及草甘膦抗性的水稻转化事件l216-44-2的定性检测和定量分析。

12、第二方面，本发明提供所述的引物对，或所述的试剂盒，或所述的侧翼序列在如下中的应用：

13、i)鉴定水稻转化事件l216-44-2的侧翼序列；

14、ii)鉴定水稻转化事件l216-44-2的插入位点；

15、iii)鉴定转基因水稻l216-44-2及其衍生产品。

16、进一步地，所述转基因水稻的第1号染色体非编码区第32196858-32196978碱基处插入pc1300-hn-eiepsps的t-dna片段。

17、第三方面，本发明提供一种检测水稻转化事件l216-44-2的方法，包括：

18、获得待测样品的基因组dna；

19、采用所述的引物对，或所述的试剂盒进行pcr扩增。

20、进一步地，还包括：

21、根据pcr扩增结果，判断所述待测样品是否含有如seq id no.1的核苷酸序列和如seq id no.2所示的核苷酸序列；

22、若如seq id no.9-10所示的引物对扩增出792bp的目的片段，说明所述待测样品包括如seq id no.2所示的核苷酸序列；

23、若如seq id no.11-12所示的引物对扩增出732bp的目的片段，说明所述待测样品包括如seq id no.1所示的核苷酸序列。

24、进一步地，若所述待测样品含有如seq id no.1的核苷酸序列和如seq id no.2所示的核苷酸序列；则判断所述待测样品含有l216-44-2来源的成分。

25、进一步地，所述pcr扩增的程序包括：

26、93-95℃1-3min；93-95℃20-40s；50-60℃20-40s；70-73℃1-2min；70-73℃5-7min；23-27℃1-3min，32-40个循环。

27、本发明具备如下有益效果：

28、本发明首次公开了水稻草甘膦除草剂抗性转化事件l216-44-2外源基因在水稻基因组中插入位点的侧翼序列，并且确认水稻草甘膦除草剂抗性转化事件l216-44-2外源基因在水稻基因组中插入位点的侧翼序列中不同碱基的来源，以及外源载体插入水稻基因组序列的接合位点序列。本发明针对水稻转化事件l216-44-2提供一种特异性引物对，建立了水稻草甘膦除草剂抗性转化事件l216-44-2的特异性定性检测方法，能够快速、准确地实现对水稻草甘膦除草剂抗性转化事件l216-44-2世代及其衍生系的检测、监测和安全管理。

技术特征：

1.一种用于检测水稻转化事件l216-44-2的引物对，其特征在于，包括：

2.一种试剂盒，其特征在于，包括：权利要求1所述的引物对。

3.一种水稻转化事件l216-44-2的侧翼序列，其特征在于，所述侧翼序列右侧翼序列如seq id no.1所示；所述侧翼序列的左侧翼序列如seq id no.2所示。

4.根据权利要求3所述的侧翼序列，其特征在于，所述侧翼序列由如seq id no.11-12所示的核苷酸序列和/如seq id no.9-10所示的核苷酸序列扩增得到。

5.权利要求1所述的引物对，或权利要求2所述的试剂盒，或权利要求3或4所述的侧翼序列在如下中的应用：

6.一种检测水稻转化事件l216-44-2的方法，其特征在于，包括：

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，还包括：

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，若所述待测样品含有如seq id no.1的核苷酸序列和如seq id no.2所示的核苷酸序列；则判断所述待测样品含有l216-44-2来源的成分。

9.根据权利要求6-8任一项所述的方法，其特征在于，所述pcr扩增的程序包括：

技术总结
本发明涉及生物工程技术领域，尤其涉及一种用于检测水稻转化事件L216‑44‑2的引物对及其应用。所述引物对包括：如SEQ ID NO.11‑12所示的核苷酸序列，和/或，如SEQ ID NO.9‑10所示的核苷酸序列。本发明针对水稻转化事件L216‑44‑2的侧翼序列设计相应的特异性引物对，其可以特异性检测水稻的第1号染色体非编码区第32196858‑32196978碱基处是否插入pC1300‑Hn‑EiEPSPS的T‑DNA片段。本发明提供的引物对可以特异性鉴定水稻转化事件L216‑44‑2，对于转基因水稻及其衍生系的检测和安全管理具有重要应用价值。

技术研发人员：安保光,欧阳超,赵光苗,赵惠敏,陈建南,陈思兰
受保护的技术使用者：海南波莲科技有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/3/12