一种鉴定棉花品种中棉113的引物和方法

本发明属于农作物鉴定领域，具体为一种鉴定棉花品种中棉113的引物和方法。

背景技术：

1、棉花是一种天然纤维植物，主要用于制作纺织品和纺织品。它的纤维柔软而坚韧，吸湿性强，适合制作各种衣物和家居用品。棉花的种子有丰富的油脂含量，可以提取棉籽油用于食品加工和工业用途。

2、棉花是我国重要的经济作物和战略物资，而新疆是我国棉花主要的种植地。中棉113是中国农业科学院棉花研究所历经多年培育的西北内陆棉品种，生育期115天的早熟特性划时代推动北疆风险棉区宜棉化，扩大了北疆植棉北界，并于2022年和2023年连续两年入选农业农村部主导品种，有效提高了棉农的收益。好的品种往往受到棉农欢迎，而受利益驱使，不良商家会采用种子套牌的方式进行售卖，导致一些假冒伪劣棉种流入市场，造成产量损失与品质下降，坑害棉农的利益，所以棉花品种的真伪鉴定在生产、加工和销售过程中及其重要。

3、传统的种子鉴别包括人工鉴别、田间种植鉴别、电泳检测、生理和化学鉴定等方法，这些方法虽能有效鉴别棉花品种，但都存在着一些缺点，如人工鉴别往往存在着经验性，鉴别精度差，而田间种植则需要消耗大量的时间人力物力，成本较高，电泳检测操作繁琐等。

技术实现思路

1、要解决的技术问题：如何通过精度高、操作简便、节省成本的方法进行棉花品种中棉113的鉴别。

2、技术方案：本发明提供了一种鉴定棉花品种中棉113的引物和方法，所述方法包括以下步骤：步骤一，收集单核苷酸多态性位点(snp)信息：从公共数据库中下载陆地棉基因组序列，借助blsat+进行基因组序列的本地化比对，找到基因组中存在的snp信息，随机从不同染色体上挑选snp并整理其基本信息，包括所在染色体、染色体物理位置、碱基变异；根据这些信息，提取snp位点上下游50bp的序列；步骤二，kasp引物设计：对步骤一中的每个snp序列命名，并将该命名用于后续步骤的snp引物名称，对上述每条序列在snp位置处标记碱基变异位点，其中，[/]即为碱基变异位点；根据kasp引物设计原则，利用primer3软件基于上述每条序列碱基变异位点分别设计三条引物序列，包括两条正向pcr引物序列和一条通用反向引物序列；其中正向引物3’端为变异的碱基，在正向引物的5’端分别添加标签序列；具体而言，第一条正向引物(f1)5’端添加fam标签的核苷酸序列：gaaggtgaccaagttcatgct，在第二条正向引物5’端添加hex标签的核苷酸序列：gaaggtcggagtcaacggatt，同时，对每条序列的下游设计通用的反向引物(c1)；步骤三，棉花品种dna准备：选取包括tm-1在内的来自西北内陆地区的棉花品种22份，具体包括陆地棉遗传标准系tm-1，其它所有的品种均来自西北内陆地区，具体包括八农212、吐71-113、库车96515、喀什736、库车t94-4、新陆早10号、莎陆1号、新陆中5号、新陆早36、博乐34、新陆早21、新陆早28、新陆中34、军棉1号、吐83-161、石河子913、科遗7号、红鸡脚叶白绒、新陆早31和新陆早7号；将以上22份棉花品种种植于营养钵中，待长出真叶后，剪取供试材料幼嫩叶片组织，采用ctab法提取基因组dna，将提取好的dna稀释成最终浓度为40ng/μl，得到待检测模板；步骤四，kasp反应体系及扩增程序：在384孔荧光定量板上进行kasp反应，每孔的混合反应体系共计5.0μl；而扩增程序分不同温度和反应时间条件下进行；步骤五，结果和数据读取：利用荧光定量仪收集扩增产物的荧光信号，对产物分型检测；待反应完成后，同一位点不同等位变异通过不同颜色或者不同形状展示，相同等位变异类型的材料以相同颜色或者相同形状的图形通过二维聚类图展示，同时导出表格形式。

3、技术效果：本发明中，针对变异位点设计特异性引物，获得的9对引物组可有效区分等位变异位点，可用于中棉113品种鉴定。采用引物组对包括中棉113在内的22份棉花品种进行差异位点分型，结果能够明显区分中棉113和其它品种基因组位点差异的检测，为中棉113品种鉴定和保护提供了新思路。

技术特征：

1.一种鉴定棉花品种中棉113的引物和方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的基于kasp技术鉴定棉花品种中棉113的方法，其特征在于，在筛选snp时，需要考虑引物设计时，注意特异性、gc含量在40-60％以及序列中重复序列低的原则。

3.根据权利要求1所述的基于kasp技术鉴定棉花品种中棉113的方法，其特征在于，所述引物组的各引物的来源没有特殊限制，采用熟知的引物来源。

技术总结
本发明涉及农作物鉴定领域，且公开了一种鉴定棉花品种中棉113的引物和方法，其包括收集单核苷酸多态性位点信息、KASP引物设计、棉花品种DNA准备、KASP反应体系及扩增程序以及结果和数据读取等五个步骤。本发明基于KASP技术用于中棉113与其它棉花品种的区别和鉴定的引物组包括9对，分别是P5‑1、P5‑2、P5‑3、P5‑6、P6‑4、P11‑1、P11‑2、P12‑3、P13‑1，并对P5‑1、P5‑2、P5‑3、P5‑6、P6‑4、P11‑1、P11‑2、P12‑3、P13‑1中碱基变异位点信息整理，针对变异位点设计特异性引物，获得的9对引物组可将同一位点的不同碱基变异明显分型，可用于中棉113品种鉴定。KASP能够利用通用荧光探针，根据引物末端不同SNP位点碱基的特异差异来对SNP分型，具有时间快、检测精度高、成本低、操作简单的优势。

技术研发人员：马雄风,赵俊杰,李威,王振玉,张先亮
受保护的技术使用者：中国农业科学院棉花研究所
技术研发日：
技术公布日：2024/3/12