一种固碳破囊壶菌菌株的构建方法

本发明属于微生物代谢工程领域，具体涉及一种破囊壶菌内源甲酸-还原甘氨酸固碳途径的鉴定及固碳破囊壶菌菌株的构建。

背景技术：

1、破囊壶菌是一类重要的真核异养原生生物，广泛存在于海洋环境中。破囊壶菌共包括9个属，分别为aurantiochytrium、thraustochytrium、botryochytrium、parietichytrium、sicyoidochytrium、japonochytrium、ulkenia和schizochytrium、monorhizochytrium。破囊壶菌可以通过异养方式利用有机底物快速生长，且能合成dha、epa等多种高价值的长链多不饱和脂肪酸等产物，在工业微生物领域具有重要应用前景。

2、一碳化合物，如co2，甲酸等已被提出作为廉价和可持续的微生物原料。全球气候变暖日趋严重，其主要原因之一是大气中的co2浓度持续增加。工业革命以来，化石燃料的大量使用导致co2排放量激增，远远超过环境容量，因此利用微生物固定co2是减缓气候变暖的重要技术手段之一。此外，甲酸是一种一碳化合物，工业上主要作为合成材料来源。作为经济且可持续的碳源，微生物将co2、甲酸等一碳化合物固定转化为细胞成分将进一步降低培养基成本且固定环境中的co2，这将在贯彻国家“双碳”战略的同时，为实现“绿色生物制造”做出贡献。还原甘氨酸固碳途径可以有效利用甲酸和co2为碳源合成甘氨酸，并最终转入到蛋白质合成中及进入中心碳代谢。

3、由于破囊壶菌的快速生长和强大的高附加值次生代谢产物合成能力，若具备固定co2和甲酸的能力，使其在合成如二十二碳五烯酸及角鲨烯等高附加值次生代谢产物的同时可固定co2、甲酸等廉价且可持续的一碳化合物，进一步降低发酵成本并实现碳负，将显著提升破囊壶菌的发酵生产潜力，促进破囊壶菌的应用范围拓展，并为减缓全球变暖提供新思路。

技术实现思路

1、本发明在于克服现有技术的不足，提供一种简易快捷的破囊壶菌还原甘氨酸途径鉴定方法，构建破囊壶菌固碳菌株并实现破囊壶菌利用来自甲酸及co2的碳原子参与高值次生代谢产物的生物合成。

2、为实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案，一种固碳破囊壶菌菌株的构建方法，主要步骤如下:

3、s1获取破囊壶菌的基因组序列、基因、氨基酸序列并进行功能注释

4、(1)在获得破囊壶菌原始基因组测序(raw data)后，使用fastp(版本：0.21.0)软件将其中的低质量序列和接头序列去除，最终获得可用的过滤后序列(clean data)。使用genomescope(版本：1.0)、jellyfish(版本：2.2.10)等2个软件进行基因组survey分析，来估计基因组大小和杂合率等情况；

5、(2)针对clean data，使用软件necat(版本：20200119)软件对其进行初步组装，随后通过软件racon(版本：1.4.13)对初步组装序列进行两轮纠错，最终得到最终的组装结果；

6、(3)基因结构预测使用同源预测、从头预测、转录本预测相结合的方法。其中，homolog同源预测(至少选两到三个近源物种；软件：exonerate(版本：v2.4.0))、de novo从头预测(软件：augustus(版本：3.3.2)、genscan(版本：1.0)、glimmerhmm(版本：3.0.4)等)、rna-seq数据通过软件stringtie(版本：2.1.4)重构得到的转录本，使用软件transdecoder(版本：v5.1.0)预测编码框。使用软件maker(版本：2.31.10)将各种方法预测得到的基因集进行整合。通过过滤，形成一个非冗余的、更加完整的基因集及氨基酸集；

7、(4)基因功能注释主要为如下两种方法。首先使用序列相似性搜索法，将基因集中基因编码的蛋白序列与现有蛋白质数据库uniprot、nr以及代谢通路数据库kegg进行diamond blastp软件(版本：2.0.11.149)比对，获得序列的功能信息，以及蛋白可能参与的代谢通路信息。其中kegg注释使用kobas(版本:3.0)软件关联到kegg orthology以及pathway。uniprot数据库记录了每个蛋白质家族与gene ontology中的功能节点的对应关系，通过此系统预测基因编码的蛋白序列所执行的生物学功能。随后使用motif相似性搜索法，利用interproscan(版本：5.52-86.0)对二级数据库interpro子数据中的cdd、gene3d、hamap、panther、pfam、phobius、pirsf、pirsr、prints、prosite、sfld、smart、superfamily、tigrfam以及tmhmm数据库进行比对，获得蛋白质的保守序列、motif和结构域等。此外，还使用软件hmmscan(版本：3.3.2)进行结构域预测，获得蛋白质的保守序列、motif和结构域等。

8、s2已知模式生物还原甘氨酸途径酶氨基酸序列的获取

9、(1)通过在genbank数据库搜检索出内源还原甘氨酸固碳途径酶氨基酸序列。

10、(2)内源还原甘氨酸固碳途径酶包括：甲酸-四氢叶酸连接酶(formate-thfligase)、甲基-四氢叶酸环化水解酶(methenyi-thf-cyclohydrolase)、亚甲基四氢叶酸脱氢酶(methylene-thf-dehydrogenase)、氨基甲基转移酶(aminomethyltransferase，glycine decarboxylase subunit t)、甘氨酸脱羧酶(glycine decarboxylase，glycinedecarboxylase subunit p)、二氢硫酰基脱氢酶(dihydrolipoyl dehydrogenase)、甘氨酸脱羧酶系统h蛋白(glycine decarboxylase subunit h)。

11、s3已知模式生物还原甘氨酸途径酶氨基酸序列与破囊壶菌氨基酸序列的多序列相似性比对(1)通过使用软件blast+(版本：2.14.0)对所有破囊壶菌氨基酸序列进行建库。

12、(2)随后使用blast+中的blastp功能依次将已知模式生物还原甘氨酸途径酶氨基酸序列作为目标序列对破囊壶菌氨基酸序列进行打分比对，根据比对结果确定破囊壶菌中是否含有对应基因。(选取分值大于200且e值小于1e-40的破囊壶菌氨基酸序列为候选基因)

13、s4破囊壶菌内源还原甘氨酸固碳途径相关酶氨基酸序列的保守结构域分析(1)利用软件ncbi conserve domains search(版本：v3.20)对预测出的破囊壶菌还原甘氨酸途径酶氨基酸序列进行保守结构域分析，并与已知模式生物还原甘氨酸途径酶氨基酸序列保守结构域进行比对，以进一步确定预测出的破囊壶菌还原甘氨酸途径酶氨基酸序列在蛋白功能上与已知模式生物的相似度。

14、s5破囊壶菌内源还原甘氨酸固碳途径的功能鉴定

15、(1)将破囊壶菌细胞在含13-c标记的甲酸(250mm)或碳酸氢钠(100mm)的驯化m4发酵培养基中生长3天后(以未标记的甲酸及碳酸氢钠为对照组；分别以13c标记的甲酸及未标记的碳酸氢钠、未标记的甲酸及13c标记的碳酸氢钠和13c标记的甲酸及含13c标记的碳酸氢钠为3个试验组)，在10000rpm下离心9ml培养物5分钟来收获细胞。用蒸馏水洗涤细胞后，使用6m hcl裂解细胞，在95℃下水解24小时，随后在95℃下完全干燥样品。将水解样品重悬于1毫升蒸馏水中，准备进行液相色谱质谱联用(lc-ms)检测13c-同位素情况。使用lcms测定细胞裂解液中甘氨酸等氨基酸中是否含有来自甲酸或碳酸氢钠的碳原子，以此表明破囊壶菌内源还原甘氨酸固碳途径是否存在及其功能。

16、(2)lc-ms参数为液相色谱使用c18反相柱，流动相为(a)水+0.1％甲酸(b)乙腈+0.1％甲酸；流速为0.4ml/min；梯度为0–1min：99％ a；1-5min：99％a到82％a(线性梯度)；5–6min：82％a到1％a(线性梯度)；6-8min：1％a；8-8.5min：从1％a到99％ a(线性梯度)；8.5–11min：99％的a；质谱仪部分使用正电离模式，扫描范围为50.0–300.0m/z，在lc梯度的前5分钟内记录光谱，最后根据目标分子量来确定母离子信号丰度。通过不同实验组结果比对，确定破囊壶菌细胞中甘氨酸碳原子是否来源于co2及甲酸以确定其co2固定和甲酸同化能力。

17、s6破囊壶菌乙酰辅酶a合成相关基因的表达

18、(1)在genbank数据库获取目的基因序列，包括丝氨酸羟甲基转移酶基因、丝氨酸脱氨酶基因、甘氨酸还原酶基因、磷酸乙酰转移酶基因、乙酸激酶和乙酰辅酶a合成酶。

19、(2)构建破囊壶菌目的基因表达载体(含博来霉素抗性标签)，分别是丝氨酸羟甲基转移酶基因-丝氨酸脱氨酶基因表达载体、甘氨酸还原酶基因表达载体及磷酸乙酰转移酶基因-乙酸激酶-乙酰辅酶a合成酶表达载体。

20、(3)将上述3种经过线性化后的表达载体与破囊壶菌感受态细胞混合后，利用电击转化法，于2000v电压下电击后，涂布于含1.5mg/ml博来霉素的m4发酵培养基中，于28℃培养5天。m4发酵培养基的配置：葡萄糖(60g/l)，酵母提取物(15g/l)，磷酸二氢钾(0.25g/l)，人工海盐(33g/l)，ph为7.0。

21、s7破囊壶菌实验室适应性进化

22、(1)首先测定破囊壶菌对不同浓度甲酸的耐受性。将破囊壶菌种子液分别接种至含有浓度为1mm、3mm、30mm、50mm、250mm、500mm及800mm甲酸钠和100mm碳酸氢钠的m4培养基(葡萄糖：20g/l，人工海盐：33g/l，磷酸二氢钾：0.25g/l，酵母提取物：1g/l，细菌蛋白胨：1.5g/l)中，于28℃，170rpm培养。随后每天测定菌液的od600值，持续6天，制作生长曲线图。

23、(2)根据破囊壶菌对不同浓度甲酸的耐受性，选取含500mm甲酸、100mm碳酸氢钠的m4培养基作为驯化培养基，将破囊壶菌种子液接种于驯化培养基中，于28℃，170rpm连续传代培养180天。

24、s8破囊壶菌高值次生代谢产物的13c同位素示踪检测

25、(1)将破囊壶菌细胞在含13-c标记的甲酸(250mm)或碳酸氢钠(100mm)的驯化m4发酵培养基中生长3天后(以未标记的甲酸及碳酸氢钠为对照组；分别以13c标记的甲酸及未标记的碳酸氢钠、未标记的甲酸及13c标记的碳酸氢钠和13c标记的甲酸及含13c标记的碳酸氢钠为3个试验组)，在10000rpm下离心9ml培养物5分钟来收获细胞。用蒸馏水洗涤细胞后，使用6m hcl裂解细胞，在95℃下水解24小时，随后在95℃下完全干燥样品。将水解样品重悬于1毫升蒸馏水中，准备进行液相色谱质谱联用(lc-ms)检测13c-同位素情况。

26、(2)dha的lc-ms检测参数：液相色谱使用c18反相柱，流动相为甲酸-乙腈体系，形成非极性梯度，流速为0.2ml/min；质谱仪部分使用负电离模式，扫描范围为100.0–1000.0m/z，使用多反应监测模式，最后根据dha的分子量来确定母离子信号丰度。角鲨烯的lc-ms检测参数：液相色谱使用c18反相柱，流动相为甲醇-水体系，形成非极性梯度，流速为0.3ml/min；质谱仪部分使用正电离模式，扫描范围为50.0–500.0m/z，使用多反应监测模式，最后根据角鲨烯的分子量来确定母离子信号丰度。

27、本发明的有益效果是：首先，破囊壶菌固碳潜力快速鉴定，对破囊壶菌的固碳潜力进行快速鉴定，有助于从自然界中筛选出高效固碳潜力的破囊壶菌底盘细胞。高效固碳破囊壶菌的获取通过此方法获得的固碳破囊壶菌具有较强的固碳能力，胞内还原甘氨酸途径的代谢通量高，实现在破囊壶菌发酵生产dha或角鲨烯的同时固定co2及甲酸等一碳化合物，响应国家“双碳”战略，进一步提升破囊壶菌发酵合成天然活性产物的可持续性。