一种多酶协同降解动物组织制备胶原蛋白寡肽和寡聚糖的方法

本发明涉及一种多酶协同降解动物组织制备胶原蛋白寡肽和寡聚糖的方法，属于生物。

背景技术：

1、胶原蛋白，简称胶原，是一种结构蛋白，大量存在于人体结缔组织如软骨和皮肤等的细胞外基质中，同时也是哺乳动物中含量最丰富的蛋白，约占人体总蛋白的三分之一。胶原蛋白种类繁多，目前已经发现30种不同的胶原蛋白。胶原蛋白是由原胶原也就是单个胶原分子组成的胶原纤维，而胶原分子通常是由三条左螺旋的氨基酸链以右螺旋的方式组成三螺旋结构，最常见的ⅰ，ⅱ，ⅲ型胶原蛋白的三螺旋结构长度约为300nm平均直径为1.5nm，氨基酸的组成却存在共同特点，三条链呈现gly-x-y的排列方式，甘氨酸残基占了总氨基酸残基的三分之一，x和y通常分别为脯氨酸和羟脯氨酸，两者约占总氨基酸组成的四分之一。由于其特殊的三螺旋结构，天然胶原蛋白具有异常的稳定性，很难被一般的蛋白酶所降解。

2、低分子量的胶原蛋白寡肽的制备方法主要分为两类：化学降解法和生物酶解法。化学降解法是目前商业化生产胶原蛋白的主要方式，尽管化学法生产低分子量胶原蛋白的工艺已经十分成熟，但也存在比如破坏氨基酸结构，产品组分单一性差、环境污染等问题。相比于化学降解法，生物酶解法具有反应条件温和、无污染、工艺简单、产品分子量易于控制、不会破坏氨基酸活性基团等优势。

3、硫酸软骨素，是共价连接在蛋白质上形成蛋白聚糖的一类糖胺聚糖。硫酸软骨素广泛分布于动物组织的细胞外基质和细胞表面，糖链由交替的葡萄糖醛酸和n-乙酰半乳糖胺(又称n-乙酰氨基半乳糖)二糖单位组成，通过一个似糖链接区连接到核心蛋白的丝氨酸残基上。硫酸软骨素表现出高生物活性，如抗癌症、抗炎、免疫调节、抗氧化等不仅在细胞转移、分化、增殖、识别以及组织形成等生物过程中起到了重要的作用，还应用于医药及临床。由于硫酸软骨素的分子量大，生物利用度低，在治疗脊柱损伤、轴突再生、抑制肿瘤发生时，硫酸软骨素的很多功效不能得到有效的发挥。目前降解产生硫酸软骨素的方法主要有：1)酸法降解，酸降解是指将硫酸软骨素溶解于酸溶液(如硫酸、盐酸)中在一定的溫度下进行降解，酸降解由于反应比较剧烈会导致硫酸根含量的降低，而且寡糖的自由基清除的能力也会降低；(2)氧化降解法，氧化降解法中最常用的方法是过氧化氢降解法，采用氧化降解法的优点是产物无毒，不需要特殊的后处理，对双糖的结构破坏比较小；(3)酶解法，酶解法是指利用硫酸软骨素酶或透明质酸酶等软骨素降解酶对硫酸软骨素酶解获得寡糖。其中，酶解法因条件温和、专一性强，是目前最常用的降解硫酸软骨素的方法。硫酸软骨素裂解酶(chondroitinase或chondroitin sulfateyase，简称为“chsase”)是一类能将硫酸软骨素、软骨素、透明质酸等糖胺聚糖降解为不饱和二糖的裂解酶。其中，硫酸软骨素abc裂解酶，为特异性最为广泛的一类硫酸软骨素裂解酶。

4、我国是农产品生产大国，每年会产生大量不能利用的农副产品，其中动物来源的蛋白质，如软骨、角、皮肤、骨头和鳞片生产和加工会产生许多副产品。这些副产品中不能食用或不能在市场上出售，进而导致环境问题，与涉及极端条件(高温、高压、腐蚀性化学品)的化学过程相比，温和条件下的酶水解提供了一种更可接受的方法来获得低毒、低环境影响的高质量生物活性提取物，可以从这些副产物中提取硫酸软骨素和胶原蛋白，从而减轻环境污染提高产品附加值。但目前采用酶解方法处理动物组织时，通常需要先对动物组织进行预处理(如酸处理或碱处理)，而后再加入酶体系进行酶解，这种方法不仅工艺繁琐，且水解效果有限，大大增加了成本，限制了对农产品的生产及加工。

技术实现思路

1、为解决上述问题，本发明以来自bacillus cereus vd021的胶原蛋白水解酶(protein id：r8hph3)为出发序列进行突变改造，随后优化其在大肠杆菌重组表达，得到的胶原蛋白水解酶可高效水解胶原蛋白，将其全部降解成胶原蛋白寡肽。与此同时，本发明还基于来自p.vulgaris(genbank:e08025.1)的硫酸软骨素裂解酶，提供了一种硫酸软骨素abc裂解酶突变体，通过大肠杆菌重组表达得到，该突变体酶可高效水解硫酸软骨素，具有重要的经济价值和社会意义。

2、本发明的第一个目的是提供一种降解动物组织的方法，包括以下步骤：

3、以未经处理的动物组织为底物，加入胶原蛋白水解酶突变体和/或硫酸软骨素abc裂解酶突变体进行酶解反应，酶解一段时间后，得到降解后的产物；

4、所述胶原蛋白水解酶突变体的氨基酸序列如seq id no.2所示，所述硫酸软骨素abc裂解酶突变体的氨基酸序列如seq id no.4所示。

5、进一步地，当加入胶原蛋白水解酶突变体进行降解时，酶解至少4小时，优选为12-24h。

6、进一步地，当加入硫酸软骨素abc裂解酶突变体进行降解时，酶解至少4小时。

7、进一步地，当加入胶原蛋白水解酶突变体时，降解后的产物中含有胶原蛋白寡肽(分子量<1kda，尤其是分子量为30-25da的短肽)。

8、进一步地，当加入硫酸软骨素abc裂解酶突变体时，降解后的产物中含有透明质酸寡聚糖和硫酸软骨素寡聚糖。

9、进一步地，当向体系中加入两种酶时，胶原蛋白水解酶突变体和硫酸软骨素abc裂解酶突变体酶量比例为1-5:1-2，2.5:1时降解效果最佳。

10、进一步地，酶解温度为30-37℃，优选为37℃。

11、进一步地，酶解ph为7.0-8.0，本发明实施例优选为7.5。

12、进一步地，所述动物组织来源包括但不限于鱼、牛、猪、鸡、鸭、鹅等的软骨组织或者富含硫酸软骨素、胶原蛋白或透明质酸的组织或底物。

13、本发明的第二个目的是提供一种酶组合物，所述组合物中含有胶原蛋白水解酶突变体和/或硫酸软骨素abc裂解酶突变体；所述胶原蛋白水解酶突变体的氨基酸序列如seqid no.2所示，所述硫酸软骨素abc裂解酶突变体的氨基酸序列如seq id no.4所示。

14、本发明的第三个目的是提供上述酶组合物在制备化妆品、功能食品或保健品中的应用，如将酶组合物水解得到的寡肽、寡聚糖添加进上述产品中。

15、本发明的第四个目的是提供一种胶原蛋白水解酶突变体，以seq id no.1所示的氨基酸序列为出发序列进行突变，所述突变为：将第74位苯丙氨酸突变为丝氨酸，并将第169位精氨酸突变为苏氨酸(f74s/r169t)，突变后的氨基酸序列如seq id no.2所示。

16、本发明还提供编码上述胶原蛋白水解酶突变体的核酸。

17、本发明还提供携带上述核酸的重组质粒。

18、本发明还提供表达上述胶原蛋白水解酶突变体的宿主细胞。

19、进一步地，所述宿主细胞为细菌、真菌、植物细胞或动物细胞。

20、本发明还提供上述胶原蛋白水解酶突变体、基因、重组质粒或宿主细胞在制备含胶原蛋白寡肽的产品中的应用。

21、本发明还提供一种生产胶原蛋白寡肽的方法，通过上述胶原蛋白水解酶突变体水解含胶原蛋白的物质得到。

22、本发明还提供一种生产上述胶原蛋白水解酶突变体的方法，包括以下步骤：以含有野生型胶原蛋白水解酶编码基因的质粒为模版，通过定点突变获得含有编码突变体基因的质粒，将该质粒转入大肠杆菌中，培养重组菌得到胶原蛋白水解酶突变体。

23、进一步地，以e.coli bl21(de3)为出发菌株。

24、进一步地，以pet系列质粒为表达载体。

25、本发明的第五个目的是提供一种硫酸软骨素abc裂解酶突变体，以seq id no.3所示的氨基酸序列为出发序列进行突变，所述突变为：将第107位谷氨酸突变为精氨酸，并将第264位丝氨酸突变为苯丙氨酸(e107r/s264f)，突变后的氨基酸序列如seq id no.4所示。

26、本发明还提供编码上述硫酸软骨素abc裂解酶的核酸。

27、本发明还提供携带上述核酸的重组质粒。

28、本发明还提供表达上述硫酸软骨素abc裂解酶突变体的宿主细胞。

29、进一步地，所述宿主细胞为细菌、真菌、植物细胞或动物细胞。

30、本发明还提供上述硫酸软骨素abc裂解酶突变体、基因、重组质粒或宿主细胞在制备含硫酸软骨素寡聚糖和/或含透明质酸寡聚糖的产品中的应用。

31、本发明还提供一种生产硫酸软骨素寡聚糖和/或含透明质酸寡聚糖的方法，通过上述硫酸软骨素abc裂解酶突变体水解含硫酸软骨素和/或含透明质酸的物质(如动物组织)得到。

32、本发明还提供一种生产上述硫酸软骨素abc裂解酶突变体的方法，包括以下步骤：以含有野生型硫酸软骨素abc裂解酶编码基因的质粒为模版，通过定点突变获得含有编码突变体基因的质粒，将该质粒转入大肠杆菌中，培养重组菌得到硫酸软骨素abc裂解酶突变体。

33、进一步地，以e.coli bl21(de3)为出发菌株。

34、进一步地，以prsf质粒为表达载体。

35、本发明的有益效果：

36、本发明提供了一种可高效降解底物的水解酶突变体和硫酸软骨素裂解酶abc突变体，用获得的胶原蛋白水解酶突变体f74s/r169t和硫酸软骨素abc裂解酶突变体e107r/s264f降解新鲜的未经处理纯化的动物组织制备低分子量胶原蛋白、低分子量硫酸软骨素、低分子量透明质酸，证明其具有良好的降解效果。